CN1061089C - 支链淀粉酶、产生它的微生物、其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种热稳定性支链淀粉酶，该支链淀粉酶具有水解支链淀粉中a-1，6型糖甙键的性质，并且在酸性介质中及约60℃8温度下具有酶促活性。
本发明也涉及产生这种支链淀粉酶的微生物菌株和制备这种支链淀粉酶的方法。
本发明也涉及该支链淀粉酶的用途和含有该产物的组合物。
本发明还涉及一种DNA分子。本发明涉及含有这种DNA分子的表达载体，并涉及含有这种DNA分子的染色体整合载体。

Description

支链淀粉酶、产生它的微生物、其制备方法和用途
本发明涉及一种新的支链淀粉酶(pullulanase)。本发明也涉及产生这种支链淀粉酶的新的微生物菌株和制造这种支链淀粉酶的方法。本发明还涉及该支链淀粉酶的用途和含有该产物的组合物。本发明还涉及一种含有该支链淀粉酶基因的DNA分子并涉及能用于在芽孢杆菌菌株中表达支链淀粉酶之含有上述DNA分子的表达载体。
基本上由直链淀粉和支链淀粉(amylopectin)构成的淀粉可通过两步骤酶促过程转变成单糖：一步是淀粉的液化，一步是液化淀粉的糖化。为了获得淀粉的高转化水平，建议在液化淀粉的糖化期间加入水解a-1，6-糖苷键的酶，例如支链淀粉酶。
欧洲专利0063909描述了一种所谓的脱支酶，即一种能水解支链淀粉中α-1，6-糖苷键的酶，该酶具有支链淀粉酶促活性并且在PH4-5和60℃下具有最佳活性。这种酶来源于酸性淀粉水解芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)菌株。
美国专利5，055，403进而提出了一种在酸性介质中具有酶足活性，并衍生于Bacillus naganoensis菌株的支链淀粉酶。该酶在60℃下测定，在PH约5时具有最大活性，而在PH4．5下测定时，则在温度约62．5℃具有大活性。
尽管在酸性PH下和温度约60℃时有活性并因此适用于糖化已液化之淀粉，但现有技术的支链淀粉酶在这种温度和PH条件下具有稳定性很低、在60℃温度和约PH4．5条件下无底物存在时半衰期不超过几十分钟的缺点。
因此，目前需要有一种能用于液化淀粉的糖化，并且在宽的温度和PH值范围内(特别是在温度60℃和PH值约4．5下)很稳定的支链淀粉酶。
本发明的目的是提供一种新的支链淀粉酶，该酶在酸性PH值下有活性，在酸性PH值下有大大超过现有技术的支链淀粉酶的热稳定性，并且在上述条件下具有几小时的半衰期。
鉴别、分离和提供天然产生所说支链淀粉酶的菌株，尤其是芽孢杆菌属菌株也是本发明的目的。
分离和提供编码所说支链淀粉酶的核苷酸序列也是本发明的目的。
制备和提供含有编码所说支链淀粉酶之上述核苷酸序列的表达载体和染色体整合载体仍然是本发明的目的。
制备和提供用含有编码所说支链淀粉酶之杆菌菌株核苷酸序列的表达载体和整合载体转化的芽孢杆菌宿主同样是本发明的目的。
为此，本发明涉及由芽孢杆菌，特别是需氧和非嗜热微生物例如脱支芽孢杆菌(Bucillus deranificans)产生的支链淀粉酶。优选使用脱支芽孢杆菌T89．117D或该脱支芽孢杆菌菌株的衍生物或突变体。
经分离和纯化的支链淀粉酶较好是由单一型(Single type)分子量约100(±10)KDa的多肽组成。
此外，所说支链淀粉酶的N-末端序列(SEQ ID NO：1)如下(以从氨基到羧基方向从左到右)：
Acp Gly Asr Thr Thr Thr Ile Ile Val His
 1                    5              10
Tyr Phe Cys Pro Ala Gly Asp Tyr Gln Pro
                15                  20
本发明涉及经分离和纯化的含有1到928个氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)或源于该序列的经修饰之序列的支链淀粉酶。这一序列是如附图4(4a到4F)所示的所说支链淀粉酶的完整氨基酸序列。
编码支链淀粉酶的完整核苷酸序列(SEQ ID NO：10)和其对应的氨基酸序列在附图4中给出。
特别优选地，所说支链淀粉酶具有4．1和4．5之间的等电点。
本发明的支链淀粉酶在宽的温度范围内是热稳定的，并且是有活性的。该支链淀粉酶在酸性PH值下是有活性的。
所说支链淀粉酶能催化存在于支链淀粉和出芽短梗孢糖(pullu-lane)中的α-1，6-糖苷链的水解。因此，它是所谓的脱支(der-amifying或debranching)酶。所说支链淀粉酶更好能水解支链淀粉中的α-1，6型糖苷键。
本发明的支链淀粉酶优先将出芽短梗孢糖断裂成麦芽三糖，将支链淀粉断裂成直链淀粉。
此外，本发明的支链淀粉酶水解支链淀粉形成低聚糖(麦芽糖低聚糖)，在此水解期间可观察到由约13个葡萄糖单元构成的低聚糖(聚合度为13，这种分子也称作“链A”)的形成，接着观察到由约47个葡萄糖单元构成的低聚糖(聚合度为47，这种分子也称作“链B”)的形成。
根据D．J．MANNERS(“Structural Analysis of Starch compo-nents by Debranching Enzymes”in“New Approaches to researchon Cereal Carbohydrates”，Amsterdam，1985，PP．45-54)和B．E．ENEVOLDSEN(“Aspects of the fine structure of starch”in“New Appoaches to research on Cereal Carbohydrates”，Ams-terdam，1985，PP．55-60)．的方法来定义具有链A和B的低聚糖。
本发明的支链淀粉酶较好地水解马铃薯支链淀粉。这一水解过程可在支链淀粉酶有最佳活性条件(即在温度约60℃和约PH4．3下)时在支链淀粉酶存在下用支链淀粉的含水悬浮液来完成。
本发明的支链淀粉酶催化麦芽糖的缩合反应，以形成四糖(具有4个葡萄糖单元的低聚糖)。
在PH值4．5和无底物存在的缓冲液液中，在温度约60℃下测定时，本发明的支链淀粉酶具有约55小时的半衰期。
半衰期是指在PH值约4．5和无底物存在的缓冲溶液中，在温度约60℃下保温55小时后测定时，支链淀粉酶表现出至少50％的相对酶促活性。
本发明的支链淀粉酶在酸性PH值下是热稳定性的。事实上，在PH值约4．5和无底物存在的缓冲溶液中在温度约60℃下保温40小时测定时，本发明的支链淀粉酶表现出至少55％的相对酶促活性。在这此相同的条件下温育24小时后测定时，该酶表现出至少70％的相对酶促活性。
相对酶促活性是指在给定PH值、温度，底物和持续时间条件下进行的试验中测得的酶促活性与在相同的试验过程中测得的最大酶促活性的比值。酶促活性从Pullulane的水解开始测定，最大酶促活性人为地规定为100。
本发明的支链淀粉酶还在宽范围的酸性PH值下是稳定的。
在下述的条件下，该支链淀粉酶在PH值大于或等于3时是有活性的。事实上，在温度约60℃，无底物存在和PH值大于或等于约3．5条件下温育60分钟后测定时，所说支链淀粉酶表现出至少85％的相对酶促活性。
在下述的条件下，该支链淀粉酶在PH值小于或等于7时是有活性的。事实上，在温度约60℃，无底物存在和PH值小于或等于5．8条件下温育60分钟后测定，所说支链淀粉酶表现出至少85％的相对酶促活性。
在这些相同条件下，在约3．8和5之间的PH值范围内测定时，所说支链淀粉酶最好表现出大于90％的相对酶促活性。
在温度约60℃，PH值大于4．0的范围内测定时，本发明的支链淀粉酶显示出最佳酶促活性。
在温度约60℃，PH值小于4．8的范围内测定时，本发明的支链淀粉酶显示出最佳酶促活性。在温度约60℃，PH约4．3下测定时，所说支链淀粉酶更好地显示出最佳酶促活性。
在PH值约4．3，55和65℃的温度范围内，特别是在60℃测定时，本发明的支链淀粉酶也显示出最佳酶促活性。
在温度约60℃， PH值范围约3．8和4．9之间，本发明的支链淀粉酶显示出大于最大酶促活性(在温度为60℃，PH值为4．3下测得的最大酶促活性)80％的酶促活性。
此外，本发明的支链淀粉酶具有所有与淀粉糖化的实际工业条件钼适应的合适性质。这些性质是低于5的最佳PH值、约60℃的最佳温度和在这些酸性PH值和升高的温度条件下的良好的酶稳定性。淀粉的工业糖化中同时使用葡萄糖淀粉酶和支链淀粉酶，因而要使用酸性介质。事实上，用于淀粉糖化的葡萄糖淀粉酶一般是由真菌，具体地说是由曲霉属真菌菌株例如黑曲霉，泡盛酒曲霉或臭曲霉菌株产生的。适于在有葡萄糖淀粉酶存在下液化淀粉糖化的理想条件是温度约60℃，PH值约4．0到4．5。具体地说，对SOLVAYENZYMES(Elkhart，United States)的以商品名DIAZYMEL-200销售的和由SOLVAY ENZYMES以商品名OPTIDEX销售的葡糖淀粉酶来说，情况正是如此。此外，糖化阶段持续几小时，一般40到60小时，在此整个阶段中所使用的酶必须是稳定、有活性并有效的，因而这些酶应在酸性介质中具有高的热稳定性和最长的可能半衰期。由于这一原因，本发明的支链淀粉酶比已知的支链淀粉酶更有效。
本发明也涉及产生支链淀粉酶的方法，包括在含有碳源，氮源和无机盐的合适营养培养基中于需氧条件下培养能产生支链淀粉酶的需氧(和非嗜热)细菌，并收获由此获得的支链淀粉酶。这种培养基可以是固体或液体的。该培养基最好是液体。
本发明还涉及产生支链淀粉酶的方法，包括在含有碳源，氮源和无机盐的合适营养培养基中于需氧条下培养脱支芽孢杆菌T89．117D(LMG P-130 56)菌株或这一菌株的能产生支链淀粉酶的衍化物，并收获由此获得的支链淀粉酶。
这些细菌的培养条件，例如培养基的组成、培养压力、温度、PH、通气和搅拌是本领域技术人员熟知的。
培养基中的碳源通常选自淀粉、部分水解淀粉、可溶淀粉、低聚糖、葡萄糖、直链淀粉、支链淀粉或它们中的两种或多种的混合物。培养其中的碳源最好选自部分水解淀粉、出芽短梗孢糖、葡萄糖或它们的混合物。用葡萄糖和部分水解淀粉已取得良好的结果。培养基中的氮源通常选自酵母提取物、黄豆粉、棉籽粉、鱼粉、明胶、马铃薯粉或它们中两种或多种的混合物。培养基中的氮源最好选自酵母提取物，黄豆粉或它们的混合物。用酵母提取物已取得良好结果。培养基中的无机盐就阴离子来说一般选自氯化物、碳酸盐、磷酸盐和硫酸盐；就阳离子来说一般选自钾、钠、铵、镁、钙、或它们中两种或多种的混合物。用下列盐的混合物已获得好结果：KH2PO4、K2HPO4·3H2O、(NH4)2SO4、MgCl2·6H2O和CaCl2·2H2O。
培养一般在温度为20和45℃之间，最好为25和40℃之间进行。
培养一般在PH值为3．5和6之间，最好为4和6之间进行。
培养一般在有空气或氧气存在同时进行搅拌的需氧条件下进行。
收获产生的支链淀粉酶的技术是本专业技术人员熟知的。通常采用离心、超滤、蒸发、沉淀、过滤、微量过滤、结晶或这些技术中一种或其它种的组合，例如离心后，接着进行超滤。
必要时，然后可纯化支链淀粉酶。用于纯化酶的技术是专业人员已知的，例如，具体地说可使用借助盐(如硫酸铵)或溶剂(主要如丙酮)的沉淀法。
支链淀粉酶也可以经喷雾或冷冻干燥法来干燥。
本发明也涉及鉴别并提供新的被分离的产生支链淀粉酶的需氧细菌。通常，它属于芽孢杆菌科，较好属于芽孢杆菌属。所说芽孢杆菌中最优选的是脱支芽孢杆菌T89．117D菌株或这一菌株的衍化物或突变体。
这一菌株的衍生物或突变体是指任何天然或人工改变的细菌。这一菌株的衍生物可采用已知的诱发变异技术，例如紫外线辐射、X-射线、诱变剂或基因工程技术获得。
脱支芽孢杆菌T98．117D菌株已按布达佩斯条约已于1993年6月21日保藏在称作BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OFMICR00RGANISMS的保藏中心(LMG culture collection，Universityof Ghent，Laboratory of Microbiology-K．L．Ledeganckstraat35，B-9000 GHENT，Belgium)，保藏号是P-13056。因此，本发明涉及脱支芽孢杆菌T89．117D的经分离和纯化的培养物和其衍生的或突变的培养物。
本发明的菌株已通过其生物化学特征鉴定：革兰氏阳性、需氧、形成内生孢子的杆状细菌。
本发明也涉及分离并提供一种DNA分子，该DNA分子含有编码脱支芽孢杆菌T89．117D(LMG P-13056)之支链淀粉酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)或由之衍生的经修饰的序列。该DNA分子最好含有脱支芽杆菌T89．117D支链淀粉酶的完整基因。所说支链淀粉酶的完整基因，至少是指转录启动子、信号序列、编码成熟支链淀粉酶的核苷酸序列和转录终止子。
按照本发明的DNA分子至少包括编码脱支芽孢杆菌T89．117D(LMGP-13056)之成熟支链淀粉酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)和其信号序列(前序列)(SEQ ID NO：13)。该DNA分子最好含有脱支芽孢杆菌T89．117D支链淀粉酶的完整基因。用含有核苷酸序列(SEQ ID NO：8)的DNA分子已获得良好结果。核苷酸序列(SEQ ID NO：8)以从氨基到羧基方向从左到右由核苷酸序列(SEQ ID M：14)、核苷酸序列(SEQ ID NO：1 3)、核苷酸序列(SEQ ID NO：10)和核苷酸序列(SEQ ID NO：15)组成。
本发明的支链淀粉酶是以含有29个氨基酸之附加序列(SEQ IDNO：12)的前体形式合成的。
本发明也涉及被修饰的支链淀粉酶，即其中的氨基酸序列中至少有一个氨基酸不同于野生酶的氨基酸序列。这些修饰可经对DNA诱变的传统技术如暴露在紫外线辐射或化学物质(如硝酸钠或间位甲基羟基胺)下，或通过基因工程技术，例如定点诱变或随机诱变获得。
本发明还涉及突变的支链淀粉酶，该变异酶经修饰编码上文定义之支链淀粉酶基因的核苷酸序列获得。获得这类突变酶的技术是专业人员已知的，具体地说，在Molecular Cloning-a Laboratorymanual-SAMBROOK，FRITSCH，MANIATIS-second edition，1989，第15章已作了描述。
本发明还涉及制备并提供一种表达载体，该载体含有包括编码脱支芽孢杆菌T89．117D支链淀粉酶之核苷酸序列的DNA分子。该DNA分子最好包含编码脱支芽孢杆菌T89．117D之成熟支链淀粉酶的结构基因。这种载体特别优选的是载体pUBDEBRA1。用载体pUBCDEBRA11也已获得良好的结果。
表达载体是指包含复制子和其它DNA区域(核苷酸序列)且作为一个完整基因表达单位不依赖宿主起作用的任何DNA序列。
完整基因表达单位是指为转录和翻译所必须的结构基因和启动区以及调节区。结构基因是指用于转录成RNA并允许由宿主合成蛋白质的编码序列。
优选的表达载体是载体pUBDEBRA1。该载体含有编码本发明脱支芽孢杆菌T89．117D菌株支链淀粉酶的基因。这种载体能引入到合适的宿主中。这种宿主一般是芽孢杆菌菌株，优选的是地衣芽孢杆菌菌株，最优选的是地衣芽孢杆菌SE2菌株。将这种载体引入到作为宿主的地衣芽孢杆菌菌株SE2 delapl中已获得了极好的结果。
本发明也涉及制备和提供一种染色体整合载体，该载体含有包括编码脱支芽孢杆菌T89．117D支链淀粉酶之核苷酸序列的DNA分子。该DNA分子最好包含编码脱支芽孢杆菌T89．117D之成熟支链淀粉酶的结构基因。这种染色体整合载体特别优选的是载体pUBCDEBRA11DNSI。
本发明也涉及用基因工程技术引入了编码支链淀粉酶之所说基因的重组菌株。该基因可由表达载体引入到质粒上或由染色体整合载体以一个或多个拷贝整合到宿主染色体中。
本发明涉及包含上述的DNA分子的地衣芽孢杆菌转化菌株。本发明涉及含有包括这种DNA分子之表达载体或染色体整合载体的地衣芽孢杆菌转化菌株。本发明更涉及包含表达载体pUBDEBRA1或染色体整合载体pUBCDEBRA11DNSI的地衣芽孢杆菌转化菌株。
本发明涉及从重组生物体开始制备所说支链淀粉酶的方法，该方法包括分离编码所说支链淀粉酶的DNA片段，将该DNA片段插入到合适的载体中，将这一载体引入到合适的宿主中或将该DNA片段引入到合适宿主的染色体中，培养所说宿主，表达所说支链淀粉酶和收获所说支链淀粉酶。所说的合适宿主一般选自大肠杆菌、芽孢杆菌属或曲霉属微生物。所说宿主一般选自芽孢杆菌属微生物。所说宿主较好选自(需氧)芽孢杆菌属微生物。所说宿主最好选自枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalopholus)，短小芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌(Bacillus Lentus)、淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或脱支芽孢杆菌(Bacillusderamificans)T89．117D(LMG P-13056)。
当用于表达本发明的支链淀粉酶的宿主是衍生于地衣芽孢杆菌，特别是地衣芽孢杆菌SE2 delapl菌株的重组菌株时，已获得了良好的结果。
地衣芽孢杆菌SE2菌株已按布达佩斯条约于1993年6月21日保藏在称作BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OFMICROORGANISMS的名藏中心(LMG Culture collection，Ghent，Belgium)，保藏号为LMG P-14034。
从地衣芽孢杆菌SE2如此获得的转化菌株SE2 delapl不同于亲本菌株的唯一事实在于在其染色体中不含有编码成热蛋白酶的DNA序列。
本发明也涉及由在野生状态含有编码碱性蛋白酶基因的芽孢杆菌属微生物以异种方式产生的支链淀粉酶。这种微生物最好是含有包含编码脱支芽孢杆菌T89．117D支链淀粉酶之核苷酸序列的DNA分子的地衣芽孢杆菌菌株。编码碱性蛋白酶的基因最好是已从该芽孢杆菌菌株中缺失。这种菌株优选的是地衣芽孢杆菌SE2 delapl。
以异种方式产生的是指不受天然微生物(即在野生状态下含有编码支链淀粉酶之基因的微生物)的影响而产生的。
本发明的支链淀粉酶在各种工业例如食品工业、制药工业或化学工业中有几种用途。
该支链淀粉酶具体来说可作为“抗腐”剂即作为防止面包在贮藏过程中发生腐败的添加剂用于面包工业或用于产生低热量啤酒的酿造工业。
该支链淀粉酶也可用于以直链淀粉作为脂肪代用品的低热量食品的制备中。
该支链淀粉酶也可用于水解支链淀粉和从这种支链淀粉开始形成低聚糖。
该支链淀粉酶也可用于从麦芽糖形成四糖。
该支链淀粉酶也可用于缩合单糖或低聚糖，产生α-1，6型键。
该支链淀粉酶也可用于例如澄清果汁。
该支链淀粉酶也可用于淀粉的液化。
为用于食品，该支链淀粉酶可固定在载体上，酶的固定化技术是专业人员熟知的。
本发明的支链淀粉酶特别适于处理淀粉和出芽短梗孢糖。
本发明涉及该支链淀粉酶在液化淀粉的糖化上的应用。
本发明也涉及该支链淀粉酶在分解淀粉或部分水解之淀粉过程中的应用，所述过程包括一个在有支链淀粉酶存在下糖化淀粉和部分水解之淀粉的阶段。这一过程通常在有一种或多种其它酶例如葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-葡糖苷酶或其它糖化酶存在下进行。
就其生物化学性质来说，本发明的支链淀粉酶允许糖化阶段在更强的酸性条件(即PH低到至少3．9，这一PH值较已知支链淀粉酶可接受的PH值的酸度更大)下进行。
就其生物化学性质来说，本发明的支链淀粉酶允许糖化阶段在相对高即高达至少65℃的温度下进行。
将本发明的支链淀粉酶加入到糖化介质中使最终获得的组合物中葡萄糖含量增加，因而，使反应产率增加。
此外，将本发明的支链淀粉酶加入到糖化介质中使得糖化周期缩短。
本发明的支链淀粉酶可实现高的淀粉转化水平。
而且，在糖化阶段，有可能用本发明的支链淀粉酶代替大部分通常使用的葡糖淀粉酶(至少60％)，而不影响葡萄糖产率。这种替代很有好处，而且事实上它可使通常得到的副产物的量大大减少。因为葡糖淀粉酶只以小比例存在，所以它不能催化从葡萄糖开始的低聚糖(含α-1，6键)的合成反应；在正常条件下，当糖化介质中达到高浓度右旋糖时，葡糖淀粉酶催化这种低聚糖合成的逆反应，它便限制了淀粉的转化水平。
另外，本发明的支链淀粉酶可使浓缩的糖化介质即具有高含量液化淀粉的介质得以使用，从经济的角度来看这是有利的，并且事实上可使得蒸发费用降低。
本发明也涉及含有本发明支链淀粉酶的酶组合物。
含有本发明支链淀粉酶的所述组合物可以固体或液体形式被使用。
可根据所期望的用途来配制支链淀粉酶。也可将稳定剂或防腐剂加入到含有本发明支链淀粉酶的酶组合物中。例如，该支链淀粉酶可通过加入丙二醇、乙二醇、甘油、淀粉、出芽短梗孢糖、糖例如葡萄糖和山梨醇、盐例如氯化钠、氯化钙、山梨酸钾和苯甲酸钠或这些物质中的两种或多种来稳定。用丙二醇已获得了良好的结果，用淀粉、苯甲酸钠和山梨酸钾的混合物也已获得了良好的结果。
按照本发明的酶组合物除了所说支链淀粉酶外还可以包含一种或多种其它酶，具体地说这些酶是碳水化合物水解酶，例如葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶、环麦芽糖糊精葡糖转移酶、β-葡糖聚糖酶和葡萄糖异构酶、糖化酶、断裂糖苷键的酶或这些酶中的两种或多种的混合物。
本发明优选涉及包含葡糖苷酶和支链淀粉酶的酶组合物。
附图1显示质粒pUBDEBRA1的限制性酶切图。
附图2显示出质粒PLD1的限制性酶切图。
附图3显示出质粒pUBCDEBRA11DNSI的限制性酶切图。
附图4(图4a到4f)示出了编码成熟支链淀粉酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)和其相应的氨基酸序列(SEQID NO：11)。
附图5(图5a到5g)示出了从质粒pUBCDEBRA11的BamHⅠ位点到PstI位点之DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)和其相应的所说支链淀粉酶的信号和成熟序列的氨基酸序列(SEQID NO：9)。未准确确定的核苷酸用符号N表示。
在这些附图中使用的符号和缩写词的含义总结下表中：
符号缩写词     含义
ORIECREPORI+0RI-KMRBLMR 大肠杆菌中的复制原点复制所需的蛋白质+股的复制起点-股的复制起点携带卡那霉素抗性的基因携带博莱霉素抗性的基因
    AMPR 携带氨苄青霉素抗性的基因
    PP Por／Por序列
   BLIAPR 编码地衣芽孢杆菌之碱性蛋白酶的序列
  5′BLIAPR 位于编码地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶序列之前的5′序列
  3′BLIAPR 位于编码地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶序列之后的3′序列
    BDEPUL 编码地衣芽孢杆菌支链淀粉酶的序列
下列实施例进一步举例说明本发明。实施例1
脱支芽孢杆菌菌株的分离和特征
在琼脂一琼脂营养培养基上分离土壤中的脱支芽孢杆菌T89．117D菌株并根据其分解由MEGAZYME公司出售的称之为AZCL的出芽短梗孢糖之显色衍生物的能力选择之。
于37℃在MYE生长培养基上培养该菌株，培养基的组成如下：KH2PO4 33mM；K2HPO4·2H2O mM；(MH4)2SO4 45mM；MgCl2·6H2O 1mM；CaCl2·2H2O 1mM；酵母提取物0．5％(重量／体积)；葡萄糖0．5％(重量／体积)。培养基的PH值用H4PO4调节到4．5。
所说琼脂一琼脂培养基(MYE／琼脂)还含有2％(重量／体积)的琼脂。
根据其生物化学性质鉴别本发明的菌株；革兰氏阳性、需氧、形成内生孢子的杆状细菌。因而它属于芽孢杆菌属。
在MYE培养基中37℃培养的该菌株的营养细胞具有大小为0．7×3．0-3．5μm的芽孢杆菌外形。营养细胞的泳动性是低的。
在MYE培养基上37℃生长3天后，显微镜观察显示出出现轻微变形的和椭园形的(亚)末端孢子囊。
在10％过氧化氢存在下的过氧化氢酶试验呈弱阳性，在1％二氯化四甲基-1，4-次苯二铵存在下的氧化酶试验呈阳性。
这一菌株是需氧的，即它在需氧环境下发育。该菌株在厌氧环境下，即在84％(V／V)N2、8％(V／V)CO2和8％(V／V)H2和环境下在37℃不发育。但是一方面它在微厌氧环境下(即82．5％(V／V)N2、6％(V／V)O2、7．5％(V／V)H2和4％(V／V)CO2环境下，37℃发育。缩写词％(V／V)代表以体积／体积表达的百分数。
这一菌株是非嗜热的，在MYE培养基中20℃、30℃、37℃和45℃保温后表现出正常的发育，但另一方面它在50℃和55℃不发育。在以磷酸盐缓冲液缓冲到PH4．0、PH4．5、PH5．0和PH5．5的MYE培养基中保温后该菌株表现出正常的发育，但另一方面它在PH7．0下则不发育。该菌株在有浓度为2．0％(W／V)和3．5％(W／V)NaCl的MYE培养基中培养后表现出正常的发育，在有5．0％(W／V)NaCl存在时表现出差的发育，在有7．0％(W／V)NaCl存在下不发育。缩写词％(W／V)代表以重量／体积表示的百分比。
该菌株不水解酪蛋白，事实上在37℃培养两周多后未观察到溶解带。它稍微分解酪氨酸，不能从丙酮酸产生3-羟基丁酮，且不将硝酸盐还原成亚硝酸盐或N3。
本发明的脱支芽孢杆菌T89．117D菌株在分类学上不同于欧洲专利0063909中所描述的脱支芽孢杆菌菌株，也不同于美国专利5，055，403中描述过的Bacillus naganoensis菌株，脱支芽孢杆菌T89．117D菌株在PH值4．7和5．5之间表现出生长，在PH值为7．0时不生长。在有3．5％(W／V)NaCl存在下发育，分解酪氨酸，并且不将硝酸盐还原成亚硝酸盐。
脱支芽孢杆菌T89．117D已以保藏登记号LMG P-13056保藏在称为BELGIAN C00RDINATED C0LLECTIONS OF MICR00RGANISMS的保藏中心(LNG culture Collection)。
实施例2
支链淀粉酶的制备
在液体培养基(MYA)中培养脱支芽孢杆菌T89．117D菌株，所说液体培养基除了酵母提取物含量和葡萄糖被淀粉代替，即酵母提取物2．5％(W／V)，马铃薯淀粉2．5％(W／V)外，其组成与MYE培养基相同。
培养在搅拌、有效通气、37℃温度下进行。
培养68小时后，支链淀粉酶和细胞生物量被离心(每分钟5000转，30分钟，BECKMAN JA-10)分离。由脱支芽孢杆菌T89 117D菌株产生的支链淀粉酶是细胞外的。
然后，支链淀粉酶被超滤(AMICON S10 Y10滤膜)浓缩，以获得支链淀粉酶的浓缩水溶液。
测定所得溶液的酶促活性。
一个支链淀粉酶单位(PUN)定义为在PH4．5，温度60℃并有出芽短梗孢糖存在下，以每分钟1μM葡萄糖当量的速率催化还原糖释放所需的酶量。
按下述方法测定支链淀粉酶的酶促活性；将1ml在50mM乙酸盐缓冲液PH4．5中的1％浓度的出芽短梗孢糖溶液在60℃保温10分钟，向其中加入0．1ml相当于活性为在0．2和1PUN／ml之间的支链淀粉酶的溶液。15分钟后加入0．4ml 0．5MNaOH终止反应，用SOMOGYINELSON[J．Bio．Chem．，153(1944)，PP．375-380；和J．Bio，Chem．，160(1945)，PP．61-68]的方法和本申请其它实施例中所述的相同方法分析释放出来的还原糖。
第二种方法用于分析支链淀粉酶。有出芽短梗孢糖存在下的酶促反应按上述试验条件进行，并加入硫酸(0．1N)仃止该反应。对出芽短梗孢糖的水解产物进行PHLC层折(BIO-RAD生产的HPX-87H柱，流动相是10mM H2SO4)，以分离各种成分。测定所得峰的面积以估计形成的麦芽三糖的量。
所谓的脱支活性，即存在于支链淀粉中的α-1，6糖苷键的水解程度，可根据在碘存在下从支链淀粉释放出的直链淀粉引起的蓝色增加来定量。
按照下述方法测定脱支酶酶促活性。0．4ml含有50mM乙酸盐缓冲液PH4．5的1％浓度的支链淀粉溶液在60℃保温10分钟，加入0．2ml支链淀粉酶开始反应，30分钟后加入0．4ml0．3M HCl仃止该反应。然后将0．8ml 0．0025％(V／V)的碘溶液加入到0．2ml上述反应混合物中，并在565mM测定光密度。
为了纯化支链淀粉酶，将支链淀粉酶的含水浓缩溶液在室温下用6份500ml的9g／l NaCl水溶液透折，如此得到的水溶液的PH值经加入25％(V／V)强度盐酸调节到PH3．5。该透析过程包括支链淀粉酶与NaCl溶液混合，然后将获得的溶液超滤。
离心(每分钟5000转，30分钟，BECKNAN JA-10)除去所得沉淀，收集离心后的上清液。加入5M NaOH将上清液的PH值调到6．0。离心除去所得沉淀物。
收集离心后的上清液，在55℃加热15分钟。再次离心(每分钟5000转，30分钟，BECKMAN JA-10)除去所形成的沉淀物，并收集离心后的上清液。
向该上清液中加入丙酮至终浓度为60％(V／V)，在2小时期间使形成的上清液的温度降至4℃。将所形成的沉淀物4℃溶解在20mM MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)和1mM CaCl2的缓冲液(PH6．0)中。该支链淀粉酶溶液称作溶液A。
溶液A再次经离子交换层折浓缩以纯化之。商品名为S-SEPHARO-SE HP HI LOAD 16／10的内体积约为20ml的柱首先以5ml／分钟的流速用含50mM CH3COONa和100mM NaCl的缓冲液(PH4．0)平衡。溶液A用乙酸盐缓冲液稀释10倍并将15ml该稀释液装柱。以80ml乙酸盐缓冲液(100mM NaCl)洗脱，接着用含有NaCl线性梯度(100-500mM)的200ml50mM乙酸盐缓冲液(PH4．0)洗脱以确保常液相。
测定每一管的支链淀粉酶活性。
将最大活性的各管内容物合并成溶液B(含有0．025mg／ml蛋白质和具有0．7PUN／ml支链淀粉酶活性的12ml溶液)。
从该溶液B开始用终浓度为80％(V／V)的丙酮进行沉淀。将所得沉淀物溶解在体积为0．6ml的含有20mM MES和1mMCaCl2的缓冲液(PH6．0)中。
该支链淀粉酶溶液称为溶液C。
溶液C有0．4mg／ml的蛋白质含量，12PUN／ml的酶促活性和30PUN／mg的比活性。
结果总结在表1中。表1
Figure 9312173600231
表1表明，这一纯化阶段使酶溶液的支链淀粉酶比活性增加10倍。
支链淀粉酶的脱支活性，即有关支链淀粉中a-1，6键的水解活性也按上所述方法根据支链淀粉水解后与碘的颜色反应进行了测定。结果表明，脱支活性也提高了。
实施例3
分子量测定
借助三氯乙酸(终浓度10％(V／V))对实施例获得的溶液C进行沉淀。将所得沉淀物溶解在由10mM TRIS／HCl(PH=8．0)、1mMEDTA 2．5％(W／V) SDS(十二烷基硫酸钠)、5％(V／V)β-硫基乙醇和0．01％(W／V)溴酚蓝组成的缓冲液中。
将4μl溶解在缓冲液中的沉淀物加在聚丙烯酰胺凝胶上。所使用的凝胶系统是PHARMACIA LKB BIOTECHNOLOGY的，含有存在SDS之10-15％(V／V)聚丙烯酰胺梯度的凝胶的PHASTSYSTEM系统。电泳条件是供货者建议的那些条件。该凝胶用考马斯蓝染色显示出分子量约105千道尔顿的多肽，它是溶液C的主要成分。
如实施例4所述，这一结果经估计成熟形式之支链淀粉酶的氨基酸序列(没有信号序列)而得以证实，并计算出其分子量为102千道尔顿。
实施例4
1．N末端序列的测定
从实施例3中描述的凝胶开始，采用BAUW et a1．，(1978)Proc．Natl．Acal．Sei．USA，84，4806-4810描述的方法测定支链淀粉酶的N末端序列。
以从氨基到羧基从左到右方向，用上述方法测知该序列(SEQID NO：1)如下：
Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Tle Val His TyrPhe Cys Pro Ala Gly Asp Tyr Gln Pro
2．支链淀粉酶氨基酸序列的测定
按照SANGER等人((1977)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74，PP．5463-5467)所述的使用二脱氧-核苷酸的链终止法测定实施例21中得到的含有支链淀粉酶基因之质粒pUBCDEBRA11的约4．5Kb的BanHⅠ-PstⅠ片段的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)
用于启动使用T7DNA聚合酶之延伸反应的合成寡核苷酸按BEAUCAGE等人((1981)Tetrahedron Letters 22，Pages 1859-1882)的方法合成。测序按照序列分析试剂盒(PHARNACIA)供货者给出的步骤进行，其中用NaOH处理变性双股DNA。
SAMBROOK，1989，PP．13，15和13．17描述了序列分析策略。按照SAMBROOK，1989，PP．13．45-13．58描述的技术制备序列分析用聚丙烯酰胺凝胶。
鉴定了pUBCDEBRA11从BamHⅠ位点到PstⅠ位点之DNA片段的核苷序列(SEQ ID NO：8)和相应的支链淀粉酶的信号和成熟序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)(附图5)。未被准确确定的核苷酸以符号N表示。
对该序列的分析显示存在一个编码支链淀粉酶的开放读码。鉴定了编码成熟支链淀粉酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)。
根据这一开放读码的翻译推断出成熟支链淀粉酶的氨基酸序列(SEQID NO：11)。附图4示出了编码成熟支链淀粉酶的核苷酸序列和其相应的氨基酸序列。
已证实如上所述从蛋白质实验测定的N末端序列对应于从DNA序列翻译出的N末端序列。
这表明，所述支链淀粉酶以含有一个29氨基酸附加序列(前序列)的前体形式被合成。该29氨基酸序列如它对应的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)一样已被鉴定(SEQ ID NO：12)。该附加序列表现出分泌信号序列的典型特征，后者在将酶排出到细胞外期间被除去(Freudl，(1992)，Iournal of Biotechnology，23．PP．231-240)。
该29氨基酸序列如下：
        ATG GCT AAA AAA CTA ATT TAT GTG TGT
        Met Ala Lys Lys Leu Ile Tyr Val Cys
                        -25
TTA AGT GTT TGT TTA GTG TTG ACC TGG GCT TTT AAT GTA
Leu Ser Val Cys Leu Val Leu Thr Trp Ala Phe Asn Val
 -20                -15                 -10
AAA GGG CAA TCT GCT CAT GCT
Lys Gly Gln Ser Ala His Ala
        -5              -1
实施例5
氨基酸分配
根据支链淀粉酶氨基酸序列(实施例4)确定的成熟支链淀粉酶的氨基酸分配总结在表2中。表2
符号 氨基酸 数量 占分子量百分数(％)
    DNVTYLKSIEQAPGFWMHRXC   天冬氨酸天冬酰胺缬氨酸苏氨酸酪氨酸亮氨酸赖氨酸丝氨酸异亮氨酸谷氨酸谷氨酰胺丙氨酸脯氨酸甘氨酸苯丙氨酸色氨酸蛋氨酸组氨酸精氨酸未知半胱氨酸     7569727042604864474039694675271823221831     8．57．77．06．96．76．76．05．55．25．14．94．84．44．23．93．33．03．02．80．30．1
实施例6
等电点的测定
以从4．0到6．5变化的PH梯度对实施例2所得的溶液C进行IEF(等电聚焦)电泳。
相当于0．12支链淀粉酶单位的体积以三份重复加在凝胶上。迁移后，三分之一的凝胶用考马斯蓝染色。
凝胶的其它两个部分用以100mM CH3COONa，1mM CaCl2和1mM MgCl2(PH4．5)缓冲的并分别含有0．1％(N／V)AZCL-Pullulane或1％(W／V)支链淀粉的琼脂胶覆盖(1％重量／体积)。如此获得的合并物(丙烯酰胺凝胶／琼脂凝胶)在饱和湿度气氛中于60℃保温16小时。然后，被支链淀粉顶层覆盖的凝胶在室温下含有3mM I2和50mM KI的溶液中保温，以便根据蓝色的出现来证明脱支链活性。
支链淀粉凝胶的碘的扩展显示出一个深蓝色的晕圈，指示出本发明的酶在约4．1和约4．5之间的等电点处有脱支链活性。支链淀粉酶活性的显现表明相同的结果。
这说明本发明的支链淀粉酶具有支链淀粉酶活性和脱支链活性。
这一结果证明本发明的支链淀粉酶能水解出芽短梗孢糖和支链淀粉两者中的α-1，6型键。这证明本发明支链淀粉酶对其底物的特异性。
这一点经按实施例4中所述估计成熟形式支链淀粉酶的氨基酸序列(无信号序列)，并由计算推断其等电点为4．5而得到进一步证实。
实施例7
由天然菌株(Bacillus dcramificans)产生之支链淀粉酶的活性随PH和温度的变化
经测定释放出的还原糖，检测在50mM柠檬酸盐／磷酸盐缓冲盐中，在不同温度(55、60和65℃)和不同PH值(从3．25到7)条件下支链淀粉酶的酶促活性。使用稀释到约1 PUN／ml的如实施例2获得的支链淀粉酶的溶液C。
结果总结在表3中。
在该试验过程中，经测定释放出的还原糖检测了置于PH约4．3和温度约60℃条件下的样品在15分钟期间的最大酶促活性。按照定义，该样品相对酶促活性应为100％。
这一实施例说明，在温度约60℃，PH在4．0和4．8范围内测定时，本发明的支链淀粉酶具有最佳酶促活性。
这一实施例也说明，在PH约4．3，温度在55和65℃之间测定时，本发明的支链淀粉酶具有最佳酶促活性。
而且，这一实施例还说明在PH约3．8和约4．9范围内，本发明的支链淀粉酶显示出大于最大酶促活性80％的酶促活性。表3
             相对酶促活性％
    PH     温度℃
    55       60        65
    3．253．754．304．905．506．006．40     5．7    2．2      4．380．8   83．7     11．587．9   100       84．182．4   87．1     6850．6   39．6     13．57．5    2．9       00       0          0
实施例8
由天然菌株(Bacillus deramificans)产生之支链淀粉酶的PH稳定性
稀释实施例2中获得的支链淀粉酶的溶液A，以使其在PH值变化范围在PH3．0至7．0的各种100mM柠檬酸盐／硝酸盐缓冲液中表现出约0．7PUN／ml的酶促活性。含有支链淀粉酶的各稀释溶液在60℃温育60分钟。
然后测定这些在1．6％(重量／体积)出芽短梗孢糖存在下在PH4．2和60℃条件下温育60分钟后的不同溶液的酶促活性。用HPLC层析法测定所形成的麦芽三糖的量(如实施例2中描述的)。结果总结在表4中。
在这一试验过程中，测定了放置在PH约4．5和温度约60℃条件下样品的最大酶促活性。按照定义，该样品的相对酶促活性应为100％。
该实施例说明，按本发明的支链淀粉酶在宽的酸性PH范围内稳定。事实上，在温度约60℃无底物存在下，PH范围在约3．5到约5．3之间温育60分钟后测定时，该酶具有至少85％的相对酶促活性。这一实施例还说明，在这些相同的条件下，PH值范围约为3．8和5之间测定时，该酶具有大于90％的相对酶促活性。只有在PH小于或等于3或大于或等于7时，该酶才被失活。表4
  PH   相对活性％
    33．544．555．566．57     09098100969289750
实施例9
由天然菌株(Bucillus deramificans)产生之支链淀粉酶的半衰期的测定
稀释如实施例2获得的支链淀粉酶的溶液C，以使其在100mM乙酸钠缓冲溶液中PH4．5时显示约0．7 PUN／ml的酶促活性。在60℃温育含有支链淀粉酶的稀释溶液，并在不同时间取样。
然后用还原糖方法(如上所述的SOM0GYI方法)测定酶促活性。
在这一试验过程中，测定了时间0时样品的最大酶促活性。因此按照定义，该样品相对酶活性应为100％。
结果总结在表5中。表5
  时间(小时)   相对活性(％)
    01624404864     1007674575447
此实施例表明，支链淀粉酶在酸性PH下是稳定的。
这一实施例说明，在这些条件下，支链淀粉酶的半衰期约55小时。事实上，在温度约60℃和无底物存在下，在PH约4．5的缓冲溶液中温育55小时后测定时，该支链淀粉酶具有至少50％的相对酶促活性。
这一实施例还说明，在温度约60℃和无底物存在下，在PH约4．5的缓冲溶液中温育40小时后测定时，本发明的支链淀粉酶具有至少55％的相对酶促活性。这一实施例也说明，在这些相同条件下温育24小时后测定时，该支链淀粉酶具有至少70％的相对酶促活性。
实施例10和实施例11R(比较)
糖化
将玉米淀粉和氯化钙悬浮在水中制备糖化介质，其中玉米淀粉的浓度以淀粉干物质重量计为35％(重量／重量)，氯化钙的浓度为0．02％(重量／体积)。
该玉米-淀粉悬浮液在有以商品名TAKATHERN L-340出售的来源于SOLVAY ENZYMES的α-淀粉酶存在下，105℃和PH6．0条件下液化5分钟。
将这样获得的液化淀粉迅速冷却至95℃，在搅拌的同时于95℃继续水解120分钟，在这一阶段，水解程度在10和12 DE(DE代表“右旋糖当量”单位，即以葡萄糖当量表示的还原端的数目)之间。
将如此获得的液化淀粉稀释至每100g糖化介质32g干重的终浓度。
将所得糖化介质冷却至60℃。
特此糖化介质的PH用乙酸调节至从3．9到4．8各种值，并在糖化过程中保持恒定。
向该糖化介质中加入数量相当于0．176 UD／g．ds(每克糖化介质干物质中葡糖淀粉酶的酶单位数)的葡糖淀粉酶。所用葡糖淀粉酶是由SOLVAY ENZYMES以商品名DIAZYNE L-200出售的。
对于本发明的实施例10，将相当于0．075PUN／g干物质的支链淀粉酶以实施例2中描述的支链淀粉酶的含水浓缩液(溶液A)的形式加入到糖化介质中。
比较实施例11R按如上所述实施例10的方法进行，但不加入支链淀粉酶。
48小时后停止糖化，所得产物用层析法进行分析(如实施例2所述)。
结果总结在表6中。
这一实施例表明，按照本发明的支链淀粉酶在糖化作用中是有效的。因此，本发明的支链淀粉酶具有符合淀粉糖化之实际工业条件的所有合适性质。
这一实施例表明，在低到高酸性PH值即至少3．9的各种PH值下，在本发明的支链淀粉酶存在下，淀粉转化水平较高。表6
 PH     实施例     以％计获得的产物
葡萄糖     DP2     DP3   ＞DP3
 3．9     11R10     94．1895．63     2．922．90     0．540．73     2．370．73
 4．2     11R10     94．1894．79     2．984．30     0．560．56     2．290．38
 4．5     11R10     93．7295．49     2．883．00     0．570．75     2．830．76
 4．8     11R10     93．3295．25     2．792．70     0．600．87     3．301．18
DP2代表含有2个葡萄糖单元的低聚糖(葡萄糖二聚体)；DP3代表含有3个葡萄糖单元的低聚糖(葡萄糖三聚体)；＞DP3表示含有大于3个葡萄糖单元的低聚糖。
实施例12和实施例13R(比较)
糖化
重复实施例10，但糖化介质PH固定在PH4．2。
将相当于0．17DU／g．ds(每克糖化介质干物质中酶单位数)的葡糖淀粉酶加入到糖化介质中，所用葡糖淀粉酶是由SOLVAYENZYMES以商品名DIAZYME L-200出售的。
对于本发明的实施例12，也将分别相当于0．0325 PUN／g．ds．，0．050 PUN／g．ds．，0．075 PUN／g．ds．和0．10 PUN／g．ds．(每克糖化介质干物质中支链淀粉酶的单位数)的支链淀粉酶以实施例2中描述的支链淀粉酶的含水浓缩液(溶液A)的形式加入到糖化介质中。
比较实施例13R按上述的实施例12的方法进行，但不加入支链淀粉酶。
结果总结在表7中。
这一实施例表明，观察到产生的葡萄糖百分比增加所必须使用的支链淀粉酶的量少于0．0325 PUN／g．ds。表7
实施例 支链淀粉酶PUN／g．ds     以％计获得的产物
葡萄糖     DP2     DP3     ＞DP3
 13R     0   94．78    3．55   0．73     0．94
 12     0．03250．0500．0750．10   95．1695．3095．2595．27    3．453．393．473．49   0．780．740．740．70     0．610．560．550．53
实施例14
质粒pUBDEBRA1的构建
质粒PUBDEBRA1(附图1)含有编码脱支芽孢杆菌T89．117D菌株支链淀粉酶，在其自身转录启动子控制下引入载体pUB131中的基因。质粒pUBDEBRA1的构建如下所述。
从脱支芽孢杆菌T89．117D菌株(保藏号LMGP-13056)提取染色体DNA并纯化之。
为此目的，在液体MYE培养基(实施例1)中制得200ml该芽孢杆菌的培养物。
当该培养物制得并处于静止期时，以每分钟5000转离心(BECKMANJA-10转子)10分钟。将如此得到的离心沉淀物加在9ml含有0．1MTRIS-HCl(三(羧甲基)氨基甲烷，以HCl酸化)PH8、0．1M EDTA(乙二胺四乙酸)和含18ml溶菌酶之0．15MNaCl的缓冲液中。将所得悬浮液在37℃保温15分钟。
然后在50℃将所得的溶胞产物用10mg／ml的RNAse溶液处理20分钟。向该溶胞产物中加入1ml 10％强度的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液。然后将该溶胞产物在70℃保温30分钟。
将溶胞产物冷却至大约45℃，然后向其中加入0．5ml 20mg／ml蛋白酶K溶液(临时制备)。
在45C保温溶胞产物，同时手动搅拌，直至获得透明溶液。
在所述条件下按照Molecular Cloning-a laboratory Manual-SANBROOK，FRITSCH，MANIATIS-second edition，989，PP．E．3所述方法对上述透明溶液进行几次苯酚提取，直到出现上述文献中所述的合适介面。
用20ml乙醇沉淀DNA，以每分钟5000转离心5分钟收集沉淀物。然后将该沉淀物悬浮在2ml PH8．0的缓冲液(10mMTRIS-HCl，1mM FDTA，PH8．0)中。
然后，所得DNA用限制性酶Sau3AI部分切断。除了限制性条件以因子10增加以获得用于以下纯化阶段的足够量的DNA外，本实施例和本申请所有其它实施例中的限制性条件都是SAMBROOK et al．(PP．5．28-5．32)所描述的那些。
调节所用DNA量和酶量的比率以得到大小在5和10kbp(kbp：103碱基对)之间的最大片段。
然后，按SAMBROOB等人(PP．6．01-6．19)描述的方法对所获得的合并片段进行琼脂糖凝胶电泳(0．8％)，并用GENE CLEAN方法分离并纯化大小在5和10kbp之间的片段。然后将这些片段与质粒pBR322(该质粒由BIOLABS公司售出[CLONTECH LABORATORIES(USA)catalogue No．6210-1])拼接，按SAMBROOK等人(PP．1．60-1．61)所述方法在BamHI位点切断并脱磷酸。其它实施例中也使用同一技术。
将这样得到的拼接物电泳(SAMBOOK et a1．，PP．1．75-1．81)转化到E．Coli MC 1061细胞(CLONTECH LABORATORIES，CataloyueNo．C-1070-1]中。细胞在含有LB(Luria-Bertani)琼脂-琼脂培养基和100μg／ml氨苄青霉素的佩特里细菌培养皿上37℃生长约18小时后挑选转化菌株。SAMBROOK等人(PP．A．4)描述了所述的LB培养基，该培养基含有10g／l胰冻、5g／l酵母提取物和10g／l氯化钠。
然后，将从这些培养皿中获得的克隆复制在含有相同培养基的培养皿上。
用含有1％(W／V)琼脂、100mM乙酸钠(PH4．5)和0．1％(W／V)AZCL-Pullulane的琼脂-琼脂培养基覆盖其中两个培养皿。在60℃保温18小时后，辨认出显示最大AZCL-Pullulane水解带的克隆，并在其它培养皿上分离相应的菌落。
从这样获得的菌株中提取称为pBREDBRA3的质粒。使用BamHⅠ和EcoRⅠ对质粒pBRDEBRA3进行双重消化得到质粒pBRDEBRA3的约4．6Kb的EcoRⅠ-BamHⅠ片段，并经琼脂糖凝胶电泳(0．8％W／V)纯化之。然后将该片段与载体pUB131(欧洲专利申请0415296中描述过)拼接，该质粒使用枯草杆菌PSL1菌株作为宿主，并预先在BamHⅠ和EcoRⅠ位点用BamHⅠ和EcoRⅠ双重消化。
枯草杆菌PSL1菌株可从B．G．S．C．保藏中心以保藏号1 AS10(BACILLUS GENETIC STOCK CENTER，Ohio StateUniversity，United States)获得。
用碱性溶胞技术(SAMBROOK et al．，PP．1．25-1．28)从转化的PSL1细胞中分离并纯化如此获得的质粒pUBDEBRA1。在其它实施例中也使用这一相同的技术。
枯草杆菌的所有转化菌株均能表达支链淀粉酶的基因并能分泌支链淀粉酶。
在含加有25μg／ml卡那霉素之LB培养基的佩特里细菌培养皿中继代培养含有质粒PUBOEBRAI的转化的PSLI菌株。
用含有AZCL-pullulane(0．1％重量／体积)和乙酸钠(100mM，PH4．5)的琼脂糖顶层覆盖所得菌落。在60℃保温18小时后，可见所有转化菌株的集落均被AZCL-pullulane的水解圈包围。
实施例15
地衣芽孢杆菌SE2 delapl菌株的制备
地衣芽孢杆菌SE2宿主菌株碱性蛋白酶基因之末端部分的鉴别
本实施例涉及宿主地衣芽孢杆菌菌株碱性蛋白酶基因末端部分的鉴别，以便制备缺失地衣芽孢株菌SE2之所说基因的缺失质粒。
1．从地衣芽孢杆菌SE2中提取染色体DNA
为分离地衣芽孢杆菌SE2染色体DNA的碱性蛋白酶基因，除培养基包含LB培养基和经纯化外，均按实施例14中所描述提取染色体DNA的方法首先提取染色体DNA 。
2．鉴别碱性蛋白酶基因的C末端部分
对提取的染色体DNA进行Molecular Cloning-SAMBROOK et al．(PP．1．85)和Molecular Cloning，a laboratory Manual，MANIATISet al．，1982，Cold Spring Harbor Laboratory，PP，374-376中描述的限制性分析。按照它们在0．8％(重量／体积)琼脂糖凝胶上的大小分离经过这些消化后得到的DNA片段。
然后，对琼脂糖凝胶用SOUTHERN BLOT技术(SAMBROOK et al．，PP．9，31描述的技术)进行分析，以便鉴别含有碱性蛋白酶基因C末端部分之核苷酸序列的片段。
为用于杂交而构建的探针是相应于碱性蛋白酶基因C末端部分的合成寡核苷酸。在BIOSEARCH CYCLONE SYNTHESIZER装置中使用β-氰基乙基-磷酸酰胺酯法合成寡核苷酸探针。用于构建合成寡核苷酸的技术已在BEAUCAGE，S．L．et al．(1981)，Tetrahedron Ltters，22，pp．1859-1882中作了描述。所构建的合成寡核苷酸序列如下(SEQ ID NO：2)；
5′-G G C G G A G C A A G C T T T G T G G-3′
这些结果表明，碱性蛋白酶基因的C末端部分位于约2．7 Kbp的PstⅠ片段上。
按照Molecular Cloning-SAMBROOK et al，-PP．9．52-9．55中描述的技术进行与DNA探针的杂交。这一技术也用于其他实施例中。
然后用酶PstⅠ消化，从地衣芽孢杆菌菌株SE2中提取的染色体DNA制备物，所得片段按其大小用琼脂糖凝胶电泳(0．8％)分离。
从该凝胶提取出所获得的约2．7 KbP PstⅠ片段并从使用玻璃珠并使用由BIO 101(USA)投放市场的所谓“GENE CLEAN”技术纯化之。
然后，使2．7 KbP的PstⅠ片段与质核PUC 18(CLONTECH Latora-tories，NO．6110-1)拼接(SAMBROOK et al．，PP．1．68-1．69)，
所说质粒已预先在PstⅠ位点被消化并已脱磷酸。然后以使用CaCl2的技术(SAMBROOK et al．，-PP．1．82-1．84)将这样获得的拼接物转化到大肠杆菌MC 1061中，SAMBROOK等人(PP．1．60-1．61)描述了使DNA片段脱磷酸或载体线性化的技术，拼接技术也由SAMBROOK等人(PP．1．68-1．69)作了描述。
在含有添加了100μg／ml氨苄青霉素之LB琼脂-琼脂培养基的培养皿上挑选转化菌株。然后与使用SOUTHERN研究中所用的C末端探针标记的合成寡核苷酸杂交以选择如此获得的从大肠杆菌MC1061开始的转化菌株，并分离质粒pKCl。
所说合成寡核苷酸按照SAMBROOK等人(PP．11．31-11．33)描述的技术，使用T4噬菌体的T4多核苷酸激酶用32P-r-ATP使之磷酸化以标记合成的寡核苷酸。
3．鉴别碱性蛋白酶基因的N末端部分
对提取的染色体DNA进行限制性分析。按照其大小在0．8％琼脂凝胶上分离所获得的DNA片段。
然后用SOUTHERN BLOT技术分析该琼脂糖凝胶以鉴定含有蛋白酶基因N末端部分的核苷酸序列。
用于杂交的探针是相应于碱性蛋白酶基因之N末端部分的合成寡核苷酸。所构建的合成寡核苷酸的序列如下(SEO ID NO：3)；
5′-A T G G C T C C T G G C G C A G G C-3′
这些结果表明，碱性蛋白酶基因的N末端部分位于5．5KbP的PstⅠ片段上，也位于约2KbP的较小的BclⅠ-PstⅠ片段上。该片段不含有限制性位点XbaⅠ、ClaⅠ、HpaⅠ和SphⅠ。
然后将从地衣芽孢杆菌菌株SE2中提取的染色体DNA制备物用酶PstⅠ消化，并将所得片段按其大小用琼脂糖凝胶泳法(0．8％)分离。
从该凝胶中提取所获得的5．5KbP的片段并用所谓“GENE CLEAN”技术(BI0 101公司)纯化之。
然后用BclⅠ、XbaⅠ、ClaⅠ、HpaⅠ和SPhⅠ系列消化，如此得到的5．5 Kbp PstⅠ片段。将所产生的DNA片段与事先用BamHⅠ和PstⅠ切成线性的质粒pMK4拼接(与在SULLIVAN et al．，(1984)Gene 29，PP．1-26描述的方法相同)。质粒pMK4可以保藏号1E29从B．G．S．C．保藏中心(Bacillus Genetic Stock Center(Ohio State University)Columbus，Ohio，USA)获得。
然后以使用CaCl2的技术将所获得的拼接物转化到大肠杆菌MC1061细胞中。
在含有添加了100μg／ml氨苄青霉素之LB琼脂-琼脂培养基的平皿上挑选转化的菌株。然后与在SOUTHERN研究中使用的末端探针标记的合成寡核苷酸杂交，以选择如此获得的从大肠杆菌MC1061开始的转化菌株，并分离质粒pKPⅠ。
实施例16
碱性蛋白酶的序列
按照SAMBROOK等人(PP．13．15和13．17和图13．3B)描述的技术从PstⅠ位点上至SacI位点测定已转入质粒pKCl pKCl中之片段的序列。
实施例17
质粒pLD1的构建
为制备地衣芽孢杆菌SE2 delapl的菌株之目的构建质粒pLD1(附图2)。质粒pLD1构建方法如下：
质粒pLD1(如实施例15获得的)在大肠杆菌MC1061中不稳定。为此，将含有地衣芽孢杆菌SE2之碱性蛋白酶基因N末端部分的染色体DNA片段引入到载体pACYC 184(BIOLABS，US，保藏号#401-M)中。将质粒pKP1的1894 bp EcoRⅠ-EcoRⅠ片段引入到质粒pACYC 184的EcoRⅠ位点而完成该引入，并用拼接物转化大肠杆菌MC 1061细胞，这样便获得了质粒pKPN11。
在含有添加了1．25μg／ml四环素之LB琼脂-琼脂培养基的平皿上挑选转化菌株。用限制性分析法(SAMBROOK et al．PP．1．85和MANIATIS et al，-PP．374-379)确定质粒pKPN11中1849bp EcoRⅠ-EcoRⅠ片段的定位。
以下述方法获得质粒pKPN12：先用StyⅠ消化，接着经用事先产生的下列合成的双股DNA取代以除去质粒pKNPN11中的1671 bpStyⅠ-StyⅠ片段。5′-CTTG GAGCTC GTTAAC AGATCT-3′(SEQ ID NO：4)3′-CTCGAG CAATTG TCTAGA GTTC-5′(SEQ ID NO：5)
(StyⅠ)SacⅠ HpaⅠ BalⅡ (StyⅠ)
按照SAMBROOR et al．-1989-Chapters 5．28-5．32中描述的技术进行质粒的限制性酶消化。
按下述方法获得源于质粒pUB131的编码卡那霉素和博莱霉素及腐草霉素抗性的DNA片段：
对质料pUB131进行PstⅠ-TaqⅠ双重消化以获得2666 bpPstⅠ-TaqⅠ片段，该片段携带编码卡那霉素、博莱霉素或腐草霉素抗性的基因。将此片段引入到质粒pBS-(STRATAGENE，USA，b编号211202)的PstⅠ-AccⅠ位点。这样获得质粒pBSKMPM。
在制备质粒pBSKMPM期间，在与质粒pBS-结合区出现小的缺失，该缺失导致质粒pBSKMPM中SphⅠ和PstⅠ位点的丧失。质粒pBSKMPM被用于产生可影响位点针对性诱变的单股DNA借以引入两个合成的核苷酸。该质粒的SamⅠ位点鉴别如下：一个在抗卡那霉素和腐草霉素抗性基因的前面，另一个在其后面。
SAMBROOK等人(PP．15．74-15．79)描述了位点针对性诱变技术，该技术使用了BIO-RAD出售的诱变试验盒(No．170-3756)。
用于诱变的合成寡核苷酸序列如下(分别为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)：
5′ -CATCTAATCTTCAACACCCGGGCCGTTTGTTGAAC-3′
              SmaⅠ
5′ -CAAAATAAAAAAGATACAACCCGGGTCTCTCGTATCTTTTAT-3′
              Smal
在两种寡核苷酸存在下用这种诱变方法获得的质粒是质粒pBSKMPM1。该质粒含有两个SmaⅠ限制性位点，该位点使含有编码抗卡那霉素和腐草霉素抗性之基因的DNA片段分离开。
然后，将质粒pBSKMPM1的1597 bp SmaⅠ-SmaⅠ片段引入到质粒pKPN12的SmaⅠ位点，由此得到质粒pKPN14。
通过限制性分析对质粒DNA制剂进行选择，以证实被引入到质粒pKPN14中之片段的合适方位(SAMBROOK et al．-pp．1．85)。
通过最初用Hind Ⅲ对质粒pKC1的1．2 Kbp SamⅠ-Hind Ⅲ片段(如实施例15获得的)进行消化，分离存在于质粒pKCl上并位于酸性蛋白酶N末端序列之前的DNA片段。
用DNA聚合聚Klenow片段处理，使Hind Ⅲ的5′突出末端变成平头末端(SAMBROOK et al．-PP．F．2-F．3)。使SacI的限制性起作用，以产生所需平头末端SacⅠ-Hind Ⅲ片段。将该片段引入到质粒pKPN14的HpaⅠ和SacⅠ位点，产生质粒pLID1。
所有这些构建体都在用来选择已转化菌株的四环素(12μg／ml)存在下转化大肠杆菌MC1061菌株。
通过替代大肠杆菌的复制功能从质粒pLID1构建能在枯草杆菌和地衣芽孢杆菌中复制的质粒。所说复制功能由质粒pLID1的3623 bp BglⅡ-BglⅡ片段携带，其被携带芽孢杆菌复制功能的片段即从质粒pUB131分离到的2238 bp BglⅡ-BamHⅠ片段所取代。
经用BglⅡ和BamHⅠ消化质粒pLID首先从质粒pLLDI中分离出3．6kbp BglⅡ-BglⅡ片段，以由芽孢杆菌细胞替代大肠杆菌复制功能。补充性BamHⅠ消化是必需的，事实上，BglⅡ单独消化会产生不能用琼脂糖凝胶电泳法分离的相同大小的片段．这样3．6Kbp BglⅡ-BglⅡ片段在枯草杆菌SE3菌株2238bp BglⅡ-BamHⅠ片段中克隆，所说2238bp BglⅡ-BamHⅠ片段已从质粒pUB131A中分离到。如此产生质粒pLD1(附图2)。
枯草杆菌SE3菌株按布达佩斯条约以保藏号LMG P-14035于1993年6月21日保藏在称作BELGIAN COORDINATEDCOLLECTIONS OF MICROORGANISMS的保藏中心。
实施例18
地衣芽孢杆菌SE2 delapl的构建
用基于同源重组的技术对地衣芽孢杆菌SE2菌株染色体DNA进行所期望的修饰。进行该修饰是为了产生地衣芽孢杆菌SE2 delapl菌株。
使用Molecular Biological Methods for Bacillus(PP．150-151)中描述的原生质体技术，按照所限定的条件将质粒pLD1转化到地衣芽孢杆菌SE2中，所不同的是，将溶菌酶粉末以5mg／ml的量加入SMMP中，代替所述方法第7阶段中限定的1mg／ml、用溶菌酶获得最大胞溶作用的保温时间是60分钟、并在含有200μm／ml卡那霉素的DM3培养基(Molecular Biological Methods forBacillus(HARWOOD et al．，eds)John Wiley and Sons(1990)(PP．150-151)中描述的)中进行再生。
分离已转化的菌株并证实已引入到该菌株中之质粒pLD1的限制性酶切图。
将转化菌株在添加2g／l葡萄糖和25μg／ml卡那霉素的50mlLB培养基中于37℃培养18小时。
取培养物样品(0．1ml)并用来接种含有50ml相同LB培养基的锥形瓶。该培养物在37℃保温18小时。取出该培养物样品，在盛有添加了25μg／ml卡那霉素和1％(重量／体积)脱脂牛奶的LB琼脂-琼脂培养基(DIFCO)的佩特里细菌培养皿上试验，以检测蛋白酶的存在。
如在克隆周围不存在显示它们在这些培养皿上生长的水解晕圈即指示这些克隆不能够产生碱性蛋白酶。
重复培养和试验，直到获得不再产生碱性蛋白酶(apr-)和卡那霉素抗性(km′)的菌株(apr-，km′)。
然后在37℃无抗生素存在的生长培养基上培养，以除去存在于该地衣芽孢杆菌SE2 delapl菌株中的质粒pLD1。
将这一菌株在添加有2g／l葡萄糖的50ml LB培养基中于37℃培养18小时。取该培养物0．1ml，用来接种另一个含有50ml相同培养基的锥形瓶，在37℃持续培养18小时。然后，取出一份样品将其散布在含有LB培养基的细菌培养皿上。将分离到的克隆在装有含25μg／ml卡那霉素之LB培养基的培养皿上再次克隆。分离一个对卡那霉素敏感(kma)的菌株，其表型被证实为(apr-，kma)。
然后分离并纯化这一菌株的染色体DNA，并且用SOUTHERNBLOT技术证实染色体缺失的结构。证实的缺失在位置上是正确的，已在位于碱性蛋白酶基因之前(5′)和之后(3′)的序列中发生了同源双股重组。
获得的该菌株被称作地衣芽孢杆菌SE2 delapl。它不产生碱性蛋白酶。
实施例19
用表达载体转化地衣芽孢杆菌SE2 delapl
从实施例14所述质粒pUBDERAl(附图1)的宿主中提取、分离并纯化该质粒(SAMBROOK et al．，1989，PP．1．25-1．28)。
制备实施例18中所述的地衣芽孢杆菌SE2菌株的培养物，然后按照MANIATIS(PP．150-151)描述的原生质体技术用上述质粒转化该菌株。
在佩特里细菌培养皿上选择转化菌株，分离并筛选纯化之。
实施例20
用地衣芽孢杆菌SE2 delapl(pUBDEBRA1)产生支链淀粉酶
将用实施例19所获得之质粒pUBDEBRA1转化的地衣芽孢杆菌SE2delapl菌株在37℃在加有0．5％(W／V)葡萄糖和20μg／ml卡那霉素的预培养LB培养基中培养17小时。将该预培养物转移(5％V／V)到50ml补充以20μg／ml卡那霉素的M2培养基中。该M2培养基含有30g大豆粉、75g可溶性淀粉、2g硫酸钠、5mg氯化镁、3g NaH2PO4，0．2g CaCl2·H2O和1000ml水。在灭菌前，该M2培养基的PH值用10N NaOH调至5．8。培养在搅拌的同时于37℃进行80小时。80小时后，以每分钟5000转离心10分钟以除去生物量。保留离心上清液。测定该上清液的酶促活性并记录其支链淀粉酶酶促活性。
实施例21
地衣芽孢杆菌SE2 delapl(pUBCDEBRA11DNSI)的构建-染色体整合
这一实施涉及将编码支链淀粉酶的基因整合到地衣芽孢杆菌SE2delapl菌株中。
为此目的，通过转化大肠杆菌MC 1061菌株，将质粒pBRDEBRA3的4．6kb EcoRⅠ-BamHⅠ片段克隆到pUBC131载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点，由此产生质粒pUBCDEBRA11。
然后经缺失质粒pUBCDEBRA11的886 bp NsiⅠ-NsiⅠ片段构建重组载体pUBCDEBRA11DNST(附图3)。如此得到的质粒由于丢失886bp的NsiⅠ片段而丧失了在芽孢杆菌中自身复制的可能性。
为实现这一构建，用NsiⅠ限制性酶切割质粒pUBCDEBRA11，用琼脂糖凝胶电泳法纯化约9．4kbp的NsiⅠ-NsiⅠ片段。然后，切接该片段，以使其重新环化。将该切接产物转化到大肠杆菌MC1D61中，获得质粒pUBCDEBRA11DNSI1。
为了将质粒pUBCDEBRA11DNSI1整合到地衣芽孢杆菌SE2 delapl菌株中，该质粒携带同源于染色体DNA的DNA片段是必要的。这样，源于地衣芽孢杆菌的染色体Sau3AⅠ片段便被克隆到整合载体pUBCDEBRA11DNSI1的BamHⅠ位点。
为此目的，用Sau3A1限制性酶部分切割从地衣芽孢杆菌SE2delapl菌株中提取的染色体DNA。然后用琼脂糖凝胶纯化大小在1．5和3kb之间的DNA片段，并将这些片段与被BamHⅠ限制性切割并脱硝酸化的质粒pUBCDEBRA11DNSI拼接。用电穿孔法将这样获得的拼接物转化到MC1061细胞中。在含有100μg／ml氨苄青霉素的LB琼脂-琼脂养基上选择后，获得约3000个克隆。将所有这些克隆悬浮在LB培养基中，用碱性溶胞技术(SAMBROOK etal．，PP．1．25-1．28)提取这些质粒。
用原生质体技术转化，将这样获得的质粒制备物引入到地衣芽孢菌SE2 delapl菌株中。在DM3再生培养基(参见MolecularBiological Methods for Bacillus(Harwood，C．R．andCutting，S．M，eds)J．Wiley and Sons，1990，PP．150-151)上选择对腐草霉素(17μg／ml)有抗性的菌株，该抗性只有通过对上述已构建之质粒之一的染色体整合来获得。
将这样获得的菌落在添加了5μg／ml腐草霉素和0．06％AZCL-Pullulane的LB琼脂-琼脂培养基上继代培养。然后分离具有最大AZCL-Pullulane水解圈的菌落，并在LB琼脂-琼脂培养基上继代培养。
然后提取该菌株的质粒内含物。用琼脂糖凝胶电泳法分析这样获得的制备物，结果表明无质粒存在。
按实施例14中所述，提取和纯化染色体DNA，并用SOUTHERN技术进行分析。分析表明，通过同源重组到约3kb的Sau3AⅠ片段中，质粒pUBCDEBRA11DNSI已整合到染色体DNA内。
这说明，编码脱支芽孢杆菌支链淀粉酶的基因在地衣芽孢杆菌中以染色体整合状态被表达。
实施例22
用地衣芽孢杆菌SE2 delapl菌株(pUBCDEBRA11DNSI)产生支链淀粉酶的方法
将如实施例21获得的含有呈染色体DNA整合形式之支链淀粉酶基因的地衣芽孢杆菌SE2 delapl菌株在添加有0．5％(W／W)葡萄糖和5μg／ml腐草霉素的预培养LB培养基中于37℃培养17小时。将10ml该预培养物接种在250ml折流瓶中的加有5μg／ml腐草霉素的M2培养基(如实施例20中描述的)中。
在搅拌的同时于37℃培养24小时，将这样获得的所有培养物转入到含有6．51 M2培养基的发酵罐中，发酵在37℃持续72小时。加入浓磷酸保持PH值在7．0以下，空气流速保持在4升／分钟，并调节搅拌速度，以使溶解氧含量大于饱和含量的30％(V／V)。
在向所获得的培养物中加入基于聚胺的以商品名OPTIFLOC FC205出售的絮凝剂50ml后，以每分钟5000转离心(BECKMAN JA-10)15分钟除去生物量，并用1M HCl溶液将所获得的上清液酸化到PH4．5。将所得溶液以每分钟8000转再次离心(BECKMANJA-10)15分钟。
使用配有分辨极限为5000道尔顿膜的超滤设备进行超滤，将该上清液浓缩至终体积为1升。
以60％终浓度(V／V)将丙酮加入到该浓溶液中。形成的上清液在4℃保温2小时，并经每分钟8000转离心(BECKMAN JA-10)15分钟。将所获得的离心残渣在PH4．5下悬浮在100ml含有30％(W／V)商品名为MALTRIN 250(GRAIN PROCESSINGCORPORATION)的淀粉、0．3％(W／V)苯甲酸钠和0．15％(W／V)山梨酸钾的水溶液中。如此得到的由重组菌株产生的支链淀粉酶的纯化制剂称作溶液D。
用还原糖法测得的溶液D的支链淀粉酶活性为150PUN／ml。
实施例23
由地衣芽孢杆菌SE2 delap1菌株(pUBCDEBRA11DNSI)产生之支链淀粉酶对温度的稳定性
稀释如实施例22中获得的支链淀粉酶的溶液D，使其在PH4．75的0．05′M柠檬酸盐／磷酸盐缓冲溶液中表现酶促活性为10至15PUN／ml。
将含有支链淀粉酶的该稀溶液以每管5ml稀溶液分袋到9个试管内。
将含有该稀溶液的所述各试管在温度40和80℃的水浴中保温75分钟。
保温后，将试管放入冰浴中迅速冷却。
然后测定(测定条件：温度60℃，PH4．5，保温时间15分钟)各溶液的酶促活性。
这一试验期间，测定了在温度约55℃置于PH约4．75下的样品的最大酶促活性。按照定义，该样品的相对酶促活性应为100％。
结果总结在表12中。表12
  温度   相对酶促活性％
    4045505560657080     9999100100968321
这一实施例表明，当在PH4．75，无底物存在下，温度小于或等于65℃的范围内保温75分钟后测定时，本发明的支链淀粉酶具有至少80％的相对酶促活性。
                    序列表(1)一般情况
(ⅰ)申请人：
(A)名称：SOLVAL(SociétéAnonyme)
(B)街：rue du Prince Albert，33
(C)城市：Bruxelles
(E)国家：Belgique
(F)邮政代码：1050
(G)电话：(02)509．61．11
(ⅱ)发明名称：支链淀粉酶、产生它的微生物、其制备方法和用途
(ⅲ)序列数15
(ⅳ)计算机可读形式：
(A)介质类型：Floppy disk
(B)计算机：IBM． PC compatable
(C)操作系统：PC-DOS／MS-DOS
(D)软件：Patent In Release #1．0，Version #1．25(OEB)(2)SEQ ID N0：1信息
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：20氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅴ)片段类型：N末端片段
(ⅵ)来源
(A)生物体：脱支芽孢杆菌(Bacill us deramificans)
(B)菌株：T89．117D
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID N0：1Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Val His Tyr Phe Cys Pro Ala1               5                  10                  15Gly Asp Tyr Gln Pro20(2)SEQ ID NO：2信息
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：19碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)股数：单股
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：核酸(oligonucleotide synthetique)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：2
      GGCGGAGCAA GCTTTGTGG(2)SEQ ID NO：3信息：
(ⅰ)序列特征
  (A)长度：18碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)股数：单股
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：核酸(合成寡核苷酸)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：3
      ATGGCTCCTG GCGCAGGC(2)SEQ ID NO：4的信息
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：22碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)股数：单股
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：核酸(合成寡核苷酸)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：4
      CTTGGAGCTC GATAACAGAT CT(2)SEQ ID NO：5信息
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：22碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)股数：单股
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：核酸(合成寡核苷酸)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：5
      CTTGAGATCT GTTAACGAGC TC(2)SEQ ID NO：6信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：36碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)股数：单股
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：核酸(合成寡核苷酸)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：6
      CATCTAATCT TCAACACCCG GGCCCGTTTG TTGAAC(2)SEQ ID NO：7信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：42碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)股数：单股
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：核酸(合成寡核苷酸)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：7：
      CAAAATAAAA AAGATACAAC CCGGGTCTCT CGTATCTTTTAT(2)SEQ ID NO：8信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：4464碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)股数：单股
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅹⅰ)序列描述 SEQ ID NO：8：GGATCCTGTT AGACTATTTG AGGAGTTTGC AACACTTGAT GTTTTATCCA AAGGAAGGGC  60CGGAGATCAT CGCTGGTCGA GGTGCTTTCG GTGAAGCATT TTCGCTATTT TGGGTATAAC 120CGGGCGCATT ACGATCAATT GTTTGAAGAG CATCTTGATT TACTTCAAAA GCTGAATGCT 180TCGAAAAGAA TAACATGGAG CGGGCTTTAT CGAACACCTA TACATGATGC AGATATCGCA 240CCCCGCCCTG TTCAGAAAAA CATTCCTTTG TGGGTTGGGG TGGGTGGGAC NMNTGAAASC 300NSYKCKYYGT GCRNVSNNNT ATGGTGCCGG CTTAGCATGG GTATTTTGTC AGGCGATTGG 350CTTCGGTTTA AGGCACTTTC GGACCTTTAT CGGCAGGCCG GCCAACAAGC ANGGTATTCA 420CCGAACGATC TGAAAGTAGG AGTGACAGGG CATGCGTTTA TTGGAAAGAC GTCGCAGCAG 480GCACTCAATG ACTATTACCC CTATCACGCG AATTATTGGC TAACACTGAA CCAACAATTA 540GGGCAGCCGT TACCCCAGCA ATACGTGAGG GAATTTAATT TATTAGCCTC CCCAGAGCAA 600GCCTTATATG TGGGAAGCTC TCAACAAGTG GGCAGGNAAA AATTTTGCGC CAACATGAGG 660NATTTGGTNA TAAACGTTTT ATCGCACAGA TCGACATTGG CGGAATGCCC TTTAAAACAG 720TGGCCAAGAA TATTGAGCGG TTAGGCCACT GAGGTTGCAC CTGTCGTACG AAGAGCAACA 780AGAGGGTAAT GGTAATAATC TATTTAACTG TTTATTAGAA AACTTGGTAT CTGTTTAATT 840AAATAACAGG AGCCTGGAAG TGGGCCAAGG CTCCTTTCTA GGGAAACCTT TTTCTATTTA 900TATAGGCGTT GTTGCCTAAG GCTAAAGTAG GATTTTATTA AAAATATAGG AATTGCTCTT 960TTATTCGACA CAATTATTCA ATGGAATACG ATAAAATGGA GAGTGTATGT AAGCGTTATA 1020TTTTATTGGG GGGCTGATAG AAGAAAAGGG ATGCGACAGG GTCTATTAGC TAGTTTGGTA 1080TTCGATTTCA GATCAATGCA ACGTACGAGT TTTTTATTGA CTGCTTTGTG CAAGCGATTG 1140CATTGAAACA AAGGAGGACA TTATGGCTAA AAAACTAATT TATGTGTGTT TAAGTGTTTG 1200TTTAGTGTTG ACCTGGGCTT TTAATGTAAA AGGGCAATCT GCTCATGCTG ATGGGAACAC 1260GACAACGATC ATTGTCCACT ATTTTTGCCC TGCTGGTGAT TATCAACCTT GGAGTCTATG 1320GATGTGGCCA AAAGACGGAG GTGGGGCTGA ATACGATTTC AATCAACCGG CTGACTCTTT 1360TGGAGCTGTT GCAAGTGCTG ATATTCCAGG AAACCCAAGT CAGGTAGGAA TTATCGTTCG 1440CACTCAAGAT TGGACCAAAG ATGTGAGCGC TGACCGCTAC ATAGATTTAA GCAAAGGAAA 1500TGAGGTGTGG CTTGTAGAAG GAAACAGCCA AATTTTTTAT AATGAAAAAG ATGCTGAGGA 1560TGCAGCTAAA CCCGCTGTAA GCAACGCTTA TTTAGATGCT TCAAACCAGG TGCTGGTTAA 1620ACTTAGCCAG CCGTTAACTC TTGGGGAAGG NNNAAGCGGC TTTACGGTTC ATGACGACAC 1680AGCAAATAAG GATATTCCAG TGACATCTGT GAAGGATGCA AGTCTTGGTC AAGATGTAAC 1740CGCTGTTTTG GCAGGTACCT TCCAACATAT TTTTGGAGGT TCCGATTGGG CACCTGATAA 1800TCACAGTACT TTATTAAAAA AGGTGACTAA CAATCTCTAT CAATTCTCAG GAGATCTTCC 1860TGAAGGAAAC TACCAATATA AAGTGGCTTT AAATGATAGC TGGAATAATC CGAGTTACCC 1920ATCTGACAAC ATTAATTTAA CAGTCCCTGC CGGCGGTGCA CACGTCACTT TTTCGTATAT 1980TCCGTCCACT CATGCAGTCT ATGACACAAT TAATAATCCT AATGCGGATT TACAAGTAGA 2040AAGCGGGGTT AAAACGGATC TCGTGACGGT TACTCTAGGG GAAGATCCAG ATGTGAGCCA 2100TACTCTGTCC ATTCAAACAG ATGGCTATCA GGCAAAGCAG GTGATACCTC GTAATGTGCT 2160TAATTCATCA CAGTACTACT ATTCAGGAGA TGATCTTGGG AATACCTATA CACAGAAAGC 2220AACAACCTTT AAAGTCTGGG CACCAACTTC TACTCAAGTA AATGTTCTTC TTTATGACAG 2280TGCAACGGGT TCTGTARCAA AAATCGTACC TATGACGGCA TCGGGCCATG GTGTGTGGGA 2340AGCAACGGTT AATCAAAACC TTGAAAATTG GTATTACATG TATGAGGTAA CAGGCCAAGG 2400CTCTACCCGA ACGGCTGTTG ATCCTTATGC AACTGCGATT GCACCAAATG GAACGAGAGG 2460CATGATTGTG GACCTGGCTA AAACAGATCC TGCTGGCTGG AACAGTGATA AACATATTAC 2520GCCAAAGAAT ATAGAAGATG AGGTCATCTA TGAAATGGAT GTCCGTGACT TTTCCATTGA 2580CCCTAATTCG GGTATGAAAA ATAAAGGGAA GTATTTGGCT CTTACAGAAA AAGGAACAAA 2640GGGCCCTGAC AACGTAAAGA CGGGGATAGA TTCCTTAAAA CAACTTGGGA TTACTCATGT 2700TCAGCTTATG CCTGTTTTCG CATCTAACAG TGTCGATGAA ACTGATCCAA CCCAAGATAA 2760TTGGGGTTAT GACCCTCGCA ACTATGATGT TCCTGAAGGG CAGTATGCTA CAAATGCGAA 2820TGGTAATGCT CGTATAAAAG AGTTTAAGGA AATGGTTCTT TCACTCCATC GTGAACACAT 2880TGGGGTTAAC ATGGATGTTG TCTATAATCA TACCTTTGCC ACGCAAATCT CTGACTTCGA 2940TAAAATTGTA CCAGAATATT ATTACCGTAC GATGATGCAG GTAATTATAC CAACGGATCA 3000GGTACTGGAA ATGAAATTGC ANGCNGAAAG GCCAATGGTT CAAAAATTTA TTATTGATTC 3060CCTTAAGTAT TGGGTCAATG AGTATCATAT TGACGGCTTC CGTTTTGACT TAATGGCGCT 3120GCTTGGAAAA GACACGATGT CCAAAGCTGC CTCGGAGCTT CATGCTATTA ATCCAGGAAT 3180TGCACTTTAC GGTGAGCCAT GGACGGGTGG AACCTCTGCA CTGCCAGATG ATCAGCTTCT 3240GACAAAAGGA GCTCAAAAAG GCATGGGAGT AGCGGTGTTT AATGACAATT TACGAAACGC 3300GTTGGACGGC AATGTCTTTG ATTCTTCCGC TCAAGGTTTT GCGACAGGTG CAACAGGCTT 3360AACTGATGCA ATTAAGAATG GCGTTGAGGG GAGTATTAAT GACTTTACCT CTTCACCAGG 3420TGAGACAATT AACTATGTCA CAAGTCATGA TAACTACACC CTTTGGGACA AAATAGCCCT 3460AAGCAATCCT AATGATTCCG AAGCGGATCG GATTAAAATG GATGAACTCG CACAAGCAGT 3540TGTTATGACC TCACAAGGCG TTCCATTCAT GCAAGGCGGG GAAGAAATGC TTCGTANAAA 3600AGGCGGCAAC GACAATAGTT ATAATGCAGG CGATGCGGTC AATGAGTTTG ATTGGAGCAG 3660GAAAGCTCAA TATCCAGATG TTTTCAACTA TTATAGCGGG CTAATCCACC TTCGTCTTGA 3720TCACCCAGCC TTCCGCATGA CGACAGCTAA TGAAATCAAT AGCCACCTCC AATTCCTAAA 3780TAGTCCAGAG AACACAGTGG CCTATGAATT AACTGATCAT GTTAATAAAG ACAAATGGGG 3840AAATATCATT GTTGTTTATA ACCCAAATAA AACTGTAGCA ACCATCAATT TGCCGAGCGG 3900GAAATGGGCA ATCAATGCTA CGAGCGGTAA GGTAGGAGAA TCCACCCTTG GTCAAGCAGA 3960GGGAAGTGTC CAAGTACCAG GTATATCTAT GATGATCCTT CATCAAGAGG TAAGCCCAGA 4020CCACGGTAAA AAGTAATAGA AAAAAGTAAA ATCCCCTCAA GATGTTTGAG GGGGATTTAG 4080TTACTTATTA TCCAATTAAT TTGCGGCTTC GGTGTTTTCA ATGGGCTCCG TATCCGTTCG 4140GTTGTGTGAT CGGACAAATG GGAGTGAATA GGTCACAAGA GCAGCAGCCA TTTCAAGCAG 4200ACCAGCGAAA GTAAACATTC GTTCTGGTGC AAATCGGGTC ATCAACCAAC CGGTAATTGC 4260TTGGGAAATA GGGATGGACC CTGACATCAC GATAATCATA ATACTAATAA CACGACCGAA 4320TAACTTAGGT GGAATAAGCG TATGGTTAAC GCTTGGAGCA ATAATATTAA CCGCCGTTTC 4380ATGAGCGCCA ACAAGCACTA GAAGGGCTAA AATAACCCAT AAGTTGTGTG TAAATCCTAT 4440AAAAAATAAC ATAAGGCCCT GCAG                                        4464(2)SEQ ID NO：9信息
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：4464碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)股数：单股
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅹⅰ)序列描述 SEQ ID NO：9：GGATCCTGTT AGACTATTTG AGGAGTTTGC AACACTTGAT GTTTTATCCA AAGGAAGGGC   60CGGAGATCAT CGCTGGTCGA GGTGCTTTCG GTGAAGCATT TTCGCTATTT TGGGTATAAC  120CGGGCGCATT ACGATCAATT GTTTGAAGAG CATCTTGATT TACTTCAAAA GCTGAATGCT  16OTCGAAAAGAA TAACATGGAG CGGGCTTTAT CGAACACCTA TACATGATGC AGATATCGCA  240CCCCGCCCTG TTCAGAAAAA CATTCCTTTG TGGGTTGGGG TGGGTGGGAC NMNTGAAASC  300NSYKCKYYGT GCRNVSNNNT ATGGTGCCGG CTTAGCATGG GTATTTTGTC AGGCGATTGG  360CTTCGGTTTA AGGCACTTTC GGACCTTTAT CGGCAGGCCG GCCAACAAGC ANGGTATTCA  420CCGAACGATC TGAAAGTAGG AGTGACAGGG CATGCGTTTA TTGGAAAGAC GTCGCAGCAG  480GCACTCAATG ACTATTACCC CTATCACGCG AATTATTGGC TAACACTGAA CCAACAATTA  540GGGCAGCCGT TACCCCAGCA ATACGTGAGG GAATTTAATT TATTAGCCTC CCCAGAGCAA  600GCCTTATATG TGGGAAGCTC TCAACAAGTG GGCAGGNAAA AATTTTGCGC CAACATGAGG  660NATTTGGTNA TAAACGTTTT ATCGCACAGA TCGACATTGG CGGAATGCCC TTTAAAACAG  720TGGCCAAGAA TATTGAGCGG TTAGGCCACT GAGGTTGCAC CTGTCGTACG AAGAGCAACA  780AGAGGGTAAT GGTAATAATC TATTTAACTG TTTATTAGAA AACTTGGTAT CTGTTTAATT  840AAATAACAGG AGCCTGGAAG TGGGCCAAGG CTCCTTTCTA GGGAAACCTT TTTCTATTTA  900TATAGGCGTT GTTGCCTAAG GCTAAAGTAG GATTTTATTA AAAATATAGG AATTGCTCTT  960TTATTCGACA CAATTATTCA ATGGAATACG ATAAAATGGA GAGTGTATGT AAGCGTTATA 1020TTTTATTGGG GGGCTGATAG AAGAAAAGGG ATGCGACAGG GTCTATTAGC TAGTTTGGTA 1080TTCGATTTCA GATCAATGCA ACGTACGAGT TTTTTATTGA CTGCTTTGTG CAAGCGATTG 1140CATTGAAACA AAGGAGGACA TT ATG GCT AAA AAA CTA ATT TAT GTG TGT      1169Met Ala Lys Lys Leu Ile Tyr Val Cys
                                       -25TTA AGT GTT TGT TTA GTG TTG ACC TGG GCT TTT AAT GTA AAA GGG CAA   1237Leu Ser Val Cys Leu Val Leu Thr Trp Ala Phe Asn Val Lys Gly Gln-20                 -15                 -10                  -5TCT GCT CAT GCT GAT GGG AAC ACG ACA ACG ATC ATT GTC CAC TAT TTT   1265Ser Ala His Ala Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Val His Tyr Phe
           -1  +1               5                  10TGC CCT GCT GGT GAT TAT CAA CCT TGG AGT CTA TGG ATG TGG CCA AAA   1333Cys Pro Ala Gly Asp Tyr Gln Pro Trp Ser Leu Trp Met Trp Pro Lys
       15                  20                  25GAC GGA GGT GGG GCT GAA TAC GAT TTC AAT CAA CCG GCT GAC TCT TTT   1381Asp Gly Gly Gly Ala Glu Tyr Asp Phe Asn Gln Pro Ala Asp Ser Phe30                  35                  40GGA GCT GTT GCA AGT GCT GAT ATT CCA GGA AAC CCA AGT CAG GTA GGA   1429Gly Ala Val Ala Ser Ala Asp Ile Pro Gly Asp Pro Ser Gln Val Gly45                  50                  55                  60ATT ATC GTT CGC ACT CAA GAT TGG ACC AAA GAT GTG AGC GCT GAC CGC   1477Ile Ile Val Arg Thr Gln Asp Trp Thr Lys Asp Val Ser Ala Asp Arg
             65                  70                  75TAC ATA GAT TTA AGC AAA GGA AAT GAG GTG TGG CTT GTA GAA GGA AAC   1525Tyr Ile Asp Leu Ser Lys Gly Asn Glu Val Trp Leu Val Glu Gly Asn
         80                  85                  90AGC CAA ATT TTT TAT AAT GAA AAA GAT GCT GAG GAT GCA GCT AAA CCC   1573Ser Gln Ile Phe Tyr Asn Glu Lys Asp Ala Glu Asp Ala Ala Lys Pro
     55                 100                 105GCT GTA AGC AAC GCT TAT TTA GAT GCT TCA AAC CAG GTG CTG GTT AAA    1621Ale Val Sar Asn Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asn Gln Val Leu Val Lys
110                 115                 120CTT AGC CAG CCG TTA ACT CTT GGG GAA GGN NNA AGC GGC TTT ACG GTT    1669Leu Ser Gln Pro Leu Thr Leu Gly Glu Gly Xaa Ser Gly Phe Thr Val125                 130                 135                 140CAT GAC GAC ACA GCA AAT AAG GAT ATT CCA GTG ACA TCT GTG AAG GAT    1717His Asp Asp Thr Ala Asn Lys Asp Ile Pro Val Thr Ser Val Lys Asp
            145                 150                 155GCA AGT CTT GGT CAA GAT GTA ACC GCT GTT TTG GCA GGT ACC TTC CAA    1765Ala ser Leu Gly Gln Asp Val Thr Ala Val Leu Ala Gly Thr Phe Gln
        160                 165                 170CAT ATT TTT GGA GGT TCC GAT TGG GCA CCT GAT AAT CAC AGT ACT TTA    1813His Ile Phe Gly Gly ser Asp Trp Ala Pro Asp Asn His Ser Thr Leu
    175                 180                 185TTA AAA AAG GTG ACT AAC AAT CTC TAT CAA TTC TCA GGA GAT CTT CCT    1862Leu Lys Lys Val Thr Asn Asn Leu Tyr Gln Phe Ser Gly Asp Leu Pro
150                 195                 200GAA GGA AAC TAC CAA TAT AAA GTG GCT TTA AAT GAT AGC TGG AAT AAT    1909Glu Gly Asn Tyr Gln Tyr Lys Val Ale Leu Asn Asp Ser Trp Asn Asn205                 210                 215                 220CCG AGT TAC CCA TCT GAC AAC ATT AAT TTA ACA GTC CCT GCC GGC GGT    1957Pro Ser Tyr Pro Ser Asp Asn Ile Asn Leu Thr Val Pro Ale Gly Gly
            225                 230                 235GCA CAC GTC ACT TTT TCG TAT ATT CCG TCC ACT CAT GCA GTC TAT GAC    2005Ala His Val Thr Phe Ser Tyr Ile Pro Ser Thr His Ala Val Tyr Asp
        240                 245                 250ACA ATT AAT AAT CCT AAT GCG GAT TTA CAA GTA GAA AGC GGG GTT AAA    2053Thr Ile Asn Ash Pro Asn Ala Asp Leu Gln Val Glu Ser Gly Val Lys
    255                 260                 265ACG GAT CTC GTG ACG GTT ACT CTA GGG GAA GAT CCA GAT GTG AGC CAT    2101Thr Asp Leu Val Thr Val Thr Leu Gly Glu Asp Pro Asp Val Ser His
270                 275                 280ACT CTG TCC ATT CAA ACA GAT GGC TAT CAG GCA AAG CAG GTG ATA CCT    2149Thr Leu Ser Ile Gln Thr Asp Gly Tyr Gln Ala Lys Gln Val Ile Pro285                 290                 295                 300CGT AAT GTG CTT AAT TCA TCA CAG TAC TAC TAT TCA GGA GAT GAT CTT    2157Arg Asn Val Leu Asn Ser Ser Gln Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu
            305                 310                 315GGG AAT ACC TAT ACA CAG AAA GCA ACA ACC TTT AAA GTC TGG GCA CCA    2245Gly Asn Thr Tyr Thr Gln Lys Ala Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro
        320                 325                 330ACT TCT ACT CAA GTA AAT GTT CTT CTT TAT GAC AGT GCA ACG GGT TCT    2293Thr Ser Thr Gln Val Asn Val Leu Leu Tyr Asp Ser Ala Thr Gly ser
    335                 340                 345GTA ACA AAA ATC GTA CCT ATG ACG GCA TCG GGC CAT GGT GTG TGG GAA    2341Val Thr Lys Ile Val Pro Met Thr Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu
350                 355                 360GCA ACG GTT AAT CAA AAC CTT GAA AAT TGG TAT TAC ATG TAT GAG GTA    2363Ala Thr Val Asn Gln Asn Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val365                 370                 375                 380ACA GGC CAA GGC TCT ACC CGA ACG GCT GTT GAT CCT TAT GCA ACT GCG    2437Thr Gly Gln Gly Ser Thr Arg Thr Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala
            385                 390                 395ATT GCA CCA AAT GGA ACG AGA GGC ATG ATT GTG GAC CTG GCT AAA ACA    2465Ile Ala Pro Asn Gly Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Lsu Ala Lys Thr
        400                 405                 410GAT CCT GCT GGC TGG AAC AGT GAT AAA CAT ATT ACG CCA AAG AAT ATA    2533Asp Pro Ala Gly Trp Asn Ser Asp Lys His Ile Thr Pro Lys Asn Ile
    415                 420                 425GAA GAT GAG GTC ATC TAT GAA ATG GAT GTC CGT GAC TTT TCC ATT GAC    2581Glu Asp Glu Val Ile Tyr Glu Met Asp Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp
430                 435                 440CCT AAT TCG GGT ATG AAA AAT AAA GGG AAG TAT TTG GCT CTT ACA GAA    2525Pro Asn Ser Gly Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu445                 450                 455                 460AAA GGA ACA AAG GGC CCT GAC AAC GTA AAG ACG GGG ATA GAT TCC TTA    2677Lys Gly Thr Lys Gly Pro Asp Asn Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu
            465                 470                 475AAA CAA CTT GGG ATT ACT CAT GTT CAG CTT ATG CCT GTT TTC GCA TCT    2725Lys Gln Leu Gly Ile Thr His Val Gln Leu Met Pro Val Pha Ala Ser
        480                 485             490AAC AGT GTC GAT GAA ACT GAT CCA ACC CAA GAT AAT TGG GGT TAT GAC    2773Asn Ser Val Asp Glu Thr Asp Pro Thr Gln Asp Asn Trp Gly Tyr Asp
    495                 500             505CCT CGC AAC TAT GAT GTT CCT GAA GGG CAG TAT GCT ACA AAT GCG AAT    2821Pro Arg Ash Tyr Asp Val Pro Glu Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn
510                 515             520GGT AAT GCT CGT ATA AAA GAG TTT AAG GAA ATG GTT CTT TCA CTC CAT    2865Gly Asn Ala Arg Ile Lys Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His525                 530             535                     540CGT GAA CAC ATT GGG GTT AAC ATG GAT GTT GTC TAT AAT CAT ACC TTT    2917Arg Glu His Ile Gly Val Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe
            545             550                     555GCC ACG CAA ATC TCT GAC TTC GAT AAA ATT GTA CCA GAA TAT TAT TAC    2965Ala Thr Gln Ile Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr
        560             565                     570CGT ACG ATG ATG CAG GTA ATT ATA CCA ACG GAT CAG GTA CTG GAA ATG    3013Arg Thr Met Met Gln Val Ile Ile Pro Thr Asp Gln Val Leu Glu Met
    575             580                     585AAA TTG CAN GCN GAA AGG CCA ATG GTT CAA AAA TTT ATT ATT GAT TCC    3061Lys Leu Xaa Ala Glu Arg Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser
590             555                     600CTT AAG TAT TGG GTC AAT GAG TAT CAT ATT GAC GGC GGC CGT TTT GAC    3109Leu Lys Tyr Trp Val Asn Glu Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp605             610                     615                 620TTA ATG GCG CTG CTT GGA AAA GAC ACG ATG TCC AAA GCT GCC TCG GAG    3157Leu Met Ala Leu Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu
            625                 630                 635CTT CAT GCT ATT AAT CCA GGA ATT GCA CTT TAC GGT GAG CCA TGG ACG    3205Leu His Ala Ile Asn Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr
        640                 645                 650GGT GGA ACC TCT GCA GTG CTG CAT GAT CAG CTT CTG ACA AAA GGA GCT    3253Gly Gly Thr Ser Ala Leu Pro Asp Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala
    655                 660                 665CAA AAA GGC ATG GGA GTA GCG GTG TTT AAT AAC AAT TTA CGA AAC GCG    3301Gln Lys Gly Met Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala
670                 675                 680TTG GAC GGC AAT GTC TTT GAT TCT TCC GCT CAA GGT TTT GCG ACA GGT    3349Leu Asp Gly Asn Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly685                 650                 695                 700GCA ACA GGC TTA ACT GAT GCA ATT AAG AAT GGC GTT GAG GGG AGT ATT    3357Ala Thr Gly Leu Thr Asp Ala Ile Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile
            705                 710                 715AAT GAC TTT ACC TCT TCA CCA GGT GAG ACA ATT AAC TAT GTC ACA AGT    3445Asn Asp Phe Thr Ser Ser Pro Gly Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser
        720                 725                 730CAT GAT AAC TAC ACC CTT TGG GAC AAA ATA GCC CTA AGC AAT CCT AAT    3453His Asp Asn Tyr Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn
    735                 740                 745GAT TCC GAA GCG GAT CGG ATT AAA ACA GAT GAA CTC GCA CAA GCA GTT    3541Asp Ser Glu Ala Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val
750                 755                 750GTT ATG ACC TCA CAA GGC GTT CCA TTC ATG CAA GGC GGG GAA GAA ATG    3589Val Met Thr Ser Gln Gly Val pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met765                 770                 775                 780CTT CGT ANA AAA GGC GGC AAC GAC AAT AGT TAT AAT GCA GGC GAT GCG    3637Leu Arg Xaa Lys Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ala
            785                 790                 795GTC AAT GAG TTT CAT TGG AGC AGG AAA GCT CAA TAT CCA GAT GTT TTC    3685Val Asn Glu Phe Asp Trp Ser Ars Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe
        800                 605                 8l0AAC TAT TAT AGC GGG CTA ATC CAC CTT CGT CTT GAT CAC CCA GCC TTC    3733Asn Tyr Tyr Ser Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe
    815                 820                 825CGC ATG ACG ACA GCT AAT GAA ATC AAT AGC CAC CTC CAA TTC CTA AAT    3781Arg Met Thr Thr Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn
830                 835                 840AGT CCA GAG AAC ACA GTG GCC TAT GAA TTA ACT GAT CAT GTT AAT AAA    3829Ser Pro Glu Asn Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys845                 850                 855                 860GAC AAA TGG GGA AAT ATC ATT GTT GTT TAT AAC CCA AAT AAA ACT GTA    3877Asp Lys Trp Gly Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Val
            865                 870                 875GCA ACC ATC AAT TTG CCG AGC GGG AAA TGG GCA ATC AAT GCT ACG AGC    3525Ala Thr Ile Asn Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser
        880                 885                 890GGT AAG GTA GGA GAA TCC ACC CTT GGT CAA GCA GAG GGA AGT GTC CAA    3973Gly Lys Val Gly Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln
    895                 900                 905GTA CCA GGT ATA TCT ATG ATG ATC CTT CAT CAA GAG GTA AGC CCA GAC    4031Val Pro Gly Ile Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp
910                 515                 920CAC GGT AAA AAG TAATAGAAAA AAGTAAAATC CCCTCAAGAT GTTTGAGGGG        4073His Gly Lys Lys925GATTTAGTTA CTTATTATCC AATTAATTTG CGGCTTCGGT GTTTTCAATG GGCTCCGTAT   4133CCGTTCGGTT GTGTGATCGG ACAAATGGGA GTGAATAGGT CACAAGAGCA GCAGCCATTT   4193CAAGCAGACC AGCGAAAGTA AACATTCGTT CTGGTGCAAA TCGGGTCATC AACCAACCGG   4253TAATTGCTTG GGAAATAGGG ATGGACCCTG ACATCACGAT AATCATAATA CTAATAACAC   4313GACCGAATAA CTTAGGTGGA ATAAGCGTAT GGTTAACGCT TGGAGCAATA ATATTAACCG   4373CCGTTTCATG AGCGCCAACA AGCACTAGAA GGGCTAAAAT AACCCATAAG TTGTGTGTAA   4433ATCCTATAAA AAATAACATA AGGCCCTGCA G                                  4464(2)SEQ ID NO：10信息
(ⅰ) 序列特征：
  (A)长度：2784碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)股数：单股
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：10GATGGGAACA CGACAACGAT CATTGTCCAC TATTTTTGCC CTGCTGGTGA TTATCAACCT     60TGGAGTCTAT GGATGTGGCC AAAAGACGGA GGTGGGGCTG AATACGATTT CAATCAACCG    120GCTGACTCTT TTGGAGCTGT TGCAAGTGCT GATATTCCAG GAAACCCAAG TCAGGTAGGA    180ATTATCGTTC GCACTCAAGA TTGGACCAAA GATGTGAGCG CTGACCGCTA CATAGATTTA    240AGCAAAGGAA ATGAGGTGTG GCTTGTAGAA GGAAACAGCC AAATTTTTTA TAATGAAAAA    300GATGCTGAGG ATGCAGCTAA ACCCGCTGTA AGCAACGCTT ATTTAGATGC TTCAAACCAG    360GTGCTGGTTA AACTTAGCCA GCCGTTAACT CTTGGGGAAG GNNNAAGCGG CTTTACGGTT    420CATGACGACA CAGCAAATAA GGATATTCCA GTGACATCTG TGAAGGATGC AAGTCTTGGT    480CAAGATGTAA CCGCTGTTTT GGCAGGTACC TTCCAACATA TTTTTGGAGG TTCCGATTGG    540GCACCTGATA ATCACAGTAC TTTATTAAAA AAGGTGACTA ACAATCTCTA TCAATTCTCA    600GGAGATCTTC CTGAAGGAAA CTACCAATAT AAAGTGGCTT TAAATGATAG CTGGAATAAT    660CCGAGTTACC CATCTGACAA CATTAATTTA ACAGTCCCTG CCGGCGGTGC ACACGTCACT    720TTTTCGTATA TTCCGTCCAC TCATGCAGTC TATGACACAA TTAATAATCC TAATGCGGAT    780TTACAAGTAG AAAGCGGGGT TAAAACGGAT CTCGTGACGG TTACTCTAGG GGAAGATCCA    840GATGTGAGCC ATACTCTGTC CATTCAAACA GATGGCTATC AGGCAAAGCA GGTGATACCT    900CGTAATGTGC TTAATTCATC ACAGTACTAC TATTCAGGAG ATGATCTTGG GAATACCTAT    960ACACAGAAAG CAACAACCTT TAAAGTCTGG GCACCAACTT CTACTCAAGT AAATGTTCTT   1020CTTTATGACA GTGCAACGGG TTCTGTAACA AAAATGGTAC CTATGACGGC ATCGGGCCAT   1080GGTGTGTGGG AAGCAACGGT TAATCAAAAC CTTGAAAATT GGTATTACAT GTATGAGGTA   1140ACAGGCCAAG GCTCTACCCG AACGGCTGTT GATCCTTATG CAACTGCGAT TGCACCAAAT   1200GGAACGAGAG GCATGATTGT GGACCTGGCT AAAACAGATC CTGCTGGCTG GAACAGTGAT   1260AAACATATTA CGCCAAAGAA TATAGAAGAT GAGGTCATCT ATGAAATGGA TGTCCGTGAC   1320TTTTCCATTG ACCCTAATTC GGGTATGAAA AATAAAGGGA AGTATTTGGC TCTTACAGAA   1380AAAGGAACAA AGGGCCCTGA CAACGTAAAG ACGGGGATAG ATTCCTTAAA ACAACTTGGG   1440ATTACTCATG TTCAGCTTAT GCCTGTTTTC GCATCTAACA GTGTCGATGA AACTGATCCA   1500ACCCAAGATA ATTGGGGTTA TGACCCTCGC AACTATGATG TTCCTGAAGG GCAGTATGCT   1560ACAAATGCGA ATGGTAATGC TCGTATAAAA GAGTTTAAGG AAATGGTTCT TTCACTCCAT   1620CGTGAACACA TTGGGGTTAA CATGGATGTT GTCTATAATC ATACCTTTGC CACGCAAATC   1680TCTGACTTCG ATAAAATTGT ACCAGAATAT TATTACCGTA CGATGATGCA GGTAATTATA   1740CCAACGGATC AGGTACTGGA AATGAAATTG CANGCNGAAA GGCCAATGGT TCAAAAATTT   1800ATTATTGATT CCCTTAAGTA TTGGGTCAAT GAGTATCATA TTGACGGCTT CCGTTTTGAC   1860TTAATGGCGC TGCTTGGAAA AGACACGATG TCCAAAGCTG CCTCGGAGCT TCATGCTATT   1920AATCCAGGAA TTGCACTTTA CGGTGAGCCA TGGACGGGTG GAACCTCTGC ACTGCCAGAT   1980GATCAGCTTC TGACAAAAGG AGCTCAAAAA GGCATGGGAG TAGCGGTGTT TAATGACAAT   2040TTACGAAACG CGTTGGACGG CAATGTCTTT GATTCTTCCG CTCAAGGTTT TGCGACAGGT   2100GCAACAGGCT TAACTGATGC AATTAAGAAT GGCGTTGAGG GGAGTATTAA TGACTTTACC   2160TCTTCACCAG GTGAGACAAT TAACTATGTC ACAAGTCATG ATAACTACAC CCTTTGGGAC   2220AAAATAGCCC TAAGCAATCC TAATGATTCC GAAGCGGATC GGATTAAAAT GGATGAACTC   2260GCACAAGCAG TTGTTATGAC CTCACAAGGC GTTCCATTCA TGCAAGGCGG GGAAGAAATG   2340CTTCGTANAA AAGGCGGCAA CGACAATAGT TATAATGCAG GCGATGCGGT CAATGAGTTT   2400GATTGGAGCA GGAAAGCTCA ATATCCAGAT GTTTTCAACT ATTATAGCGG GCTAATCCAC   2460CTTCGTCTTG ATCACCCAGC CTTCCGCATG ACGACAGCTA ATGAAATCAA TAGCCACCTC   2520CAATTCCTAA ATAGTCCAGA GAACACAGTG GCCTATGAAT TAACTGATCA TGTTAATAAA   2580GACAAATGGG GAAATATCAT TGTTGTTTAT AACCCAAATA AAACTGTAGC AACCATCAAT   2640TTGCCGAGCG GGAAATGGGC AATCAATGCT ACGAGCGGTA AGGTAGGAGA ATCCACCCTT   2700GGTCAAGCAG AGGGAAGTGT CCAAGTACCA GGTATATCTA TGATGATCCT TCATCAAGAG   2760GTAAGCCCAG ACCACGGTAA AAAG                                          2784(2) SEQ ID NO：11信息
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：928氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：11Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Val His Tyr Phe Cys Pro Ala Gly1               5                  10                  15Asp Tyr Gln Pro Trp Ser Leu Trp Met Trp Pro Lys Asp Gly Gly Gly
         20                  25                  30Ala Glu Tyr Asp Phe Asn Gln Pro Ala Asp Ssr Phe Gly Ala Val Ala
     35                  40                  45Ser Ala Asp Ile Pro Gly Asn Pro Ser Gln Val Gly Ile Ile Val Arg
 50                  55                  60Thr Gln Asp Trp Thr Lys Asp Val Ser Ala Asp Arg Tyr Ile Asp Leu65                  70                  75                  80Ser Lys Gly Asn Glu Val Trp Leu Val Glu Gly Asn Ser Gln Ile Phe
             85                  90                  95Tyr Asn Glu Lys Asp Ala Glu Asp Ala Ala Lys Pro Ala Val Ser Asn
        100                 105                 110Ala Tyr Leu Asp Ale Ser Asn Gln Val Leu Val Lys Leu Ser Gln Pro
    115                 120                 125Leu Thr Leu Gly Glu Gly Xaa Ser Gly Phe Thr Val His Asp Asp Thr
130                 135                 140Ala Asn Lys Asp Ile Pro Val Thr Ser Val Lys Asp Ala Ser Leu Gly145                 150                 155                 160Gln Asp Val Thr Ala Val Leu Ala Gly Thr Phe Gln His Ile Phe Gly
            165                 170                 175Gly Ser Asp Trp Ala Pro Asp Asn His Ser Thr Leu Leu Lys Lys Val
        180                 185                 190Thr Asn Asn Leu Tyr Gln Phe Ser Gly Asp Leu Pro Glu Gly Asn Tyr
    195                 200                 205Gln Tyr Lys Val Ala Leu Asn Asp Ser Trp Asn Asn Pro Ser Tyr Pro
210                 215                 220Ser Asp Asn Ile Asn Leu Thr Val pro Ala Gly Gly Ala His Val Thr225                 230                 235                 240Phe Ser Tyr Ile Pro Ser Thr His Ala Val Tyr Asp Thr Ile Asn Asn
            245                 250                 255Pro Asn Ale Asp Leu Gln Val Glu Ser Gly Val Lys Thr Asp Leu Val
        260                 265                 270Thr Val Thr Leu Gly Glu Asp Pro Asp Val Ser His Thr Leu Ser Ile
    275                 280                 285Gln Thr Asp Gly Tyr Gln Ala Lys Gln Val Ile Pro Arg Asn Val Leu
290                 295                 300Asn Ser Ser Gln Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asn Thr Tyr305                 310                 315                 320Thr Gln Lys Ala Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro Thr Ser Thr Gln
            325                 330                 335Val Asn Val Leu Leu Tyr Asp Ser Ala Thr Gly ser Val Thr Lys Ile
        340                 345                 350Val Pro Met Tnr Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu Ala Thr Val Asn
    355                 360                 365Gln Asn Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val The Gly Gln Gly
370                 375                 380Ser Thr Arg Thr Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Ile Ala Pro Asn385                 390                 395                 400Gly Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp Pro Ala Gly
            405                 410                 4l5Trp Asn Ser Asp Lys His Ile Thr Pro Lys Asn Ils Glu Asp Glu Val
        420                 425                 430Ile Tyr Glu Met Asp Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Pro Asn Ser Gly
    435                 440                 445Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr Lys
450                 455                 460Gly Pro Asp Asn Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Gln Leu Gly465                 470                 475                 480Ile Thr His Val Gln Leu Met Pro Val Phe Ala Ser Asn Ser Val Asp
            485                 490                 495Glu Thr Asp Pro Thr Gln Asp Asn Trp Gly Tyr Asp pro Arg Asn Tyr
        500                 505                 5l0Asp Val Pro Glu Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Asn Ala Ar
    515                 520                 525Ile Lys Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Arg Glu His Ile
530                 535                 540Gly Val Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile545                 550                 555                 560Ssr Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Met Met
            565                 570                 575Gln Val Ile Ile Pro Thr Asp Gln Val Leu Glu Met Lys Leu Xaa Ala
        580                 585                 590Glu Arg Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Tyr Trp
    595                 600                 605Val Asn Glu Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu
610                 615                 620Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu His Ala Ile626                 630                 635                 640Asn Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser
            645                 650                 655Ala Leu Pro Asp Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met
        660                 665                 670Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn
    675                 680                 685Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu
690                 695                 700Thr Asp Ala Ile Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr705                 710                 715                 720Ser Ser Pro Gly Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Tyr
            725                 730                 735Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala
        740                 745                 750Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr Ser
    755                 760                 765Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Xea Lys
770                 775                 780Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ala Val Asn Glu Phe785                 790                 795                 800Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser
            805                 810                 815Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr
        820                 825                 630Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn
    835                 840                 845Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gl
850                 855                 860Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Val Ala Thr Ile Asn865                 870                 875                 880Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly
            885                 890                 895Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile
        900                 905                 910Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys
    915                 920                 925(2) SEQ ID NO：12信息
(ⅰ)序列特征
  (A)长度：29氨基酸
  (B)类型：肽
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO：12：Met Ala Lys Lys Leu Ile Tyr Val Cys Leu Ser Vel Cys Leu Val Leu
            -25                 -20                 -15Thr Trp Ala Phe Asn Val Lys Gly Gln Ser Ala His Ala
        -10                 -5               -1(2)SEQ ID NO：13信息
(ⅰ)序列特征；
  (A)长度：87碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)股数：单
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：核酸
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO：13：ATG GCT AAA AAA CTA ATT TAT GTG TGT TTA AGT GTT TGT TTA GTG TTG     60Met Ala Lys Lys Leu Ile Tyr Val Cys Leu Ser Val Cys Leu Val Leu
            -25                 -20                 -15ACC TGG GCT TTT AAT GTA AAA GGG CAA TCT GCT CAT GCT                 87Thr Trp Ala Phe Asn Val Lys Gly Gln Ser Ala His Ala
        -10                  -5              -2(2)SEQ ID NO：14信息
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：1162碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)股数：单股
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：核酸
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO：14：GGATCCTGTT AGACTATTTG AGGAGTTTGC AACACTTGAT GTTTTATCCA AAGGAAGGGC   60CGGAGATCAT CGCTGGTCGA GGTGCTTTCG GTGAAGCATT TTCGCTATTT TGGGTATAAC  120CGGGCGCATT ACGATCAATT GTTTGAAGAG CATCTTGATT TACTTCAAAA GCTGAATGCT  180TCGAAAAGAA TAACATGGAG CGGGCTTTAT CGAACACCTA TACATGATGC AGATATCGCA  240CCCCGCCCTG TTCAGAAAAA CATTCCTTTG TGGGTTGGGG TGGGTGGGAC NMNTGAAASC  300NSYKCKYYGT GCRNVSNNKT ATGGTGCCGG CTTAGCATGG GTATTTTGTC AGGCGATTGG  360CTTCGGTTTA AGGCACTTTC GGACCTTTAT CGGCAGGCCG GCCAACAAGC ANGGTATTCA  420CCGAACGATC TGAAAGTAGG AGTGACAGGG CATGCGTTTA TTGGAAAGAC GTCGCAGCAG  480GCACTCAATG ACTATTACCC CTATCACGCG AATTATTGGC TAACACTGAA CCAACAATTA  540GGGCAGCCGT TACCCCAGCA ATACGTGAGG GAATTTAATT TATTAGCCTC CCCAGAGCAA  600GCCTTATATG TGGGAAGCTC TCAACAAGTG GGCAGGNAAA AATTTTGCGC CAACATGAGG  660NATTTGGTNA TAAACGTTTT ATCGCACAGA TCGACATTGG CGGAATGCCC TTTAAAACAG  720TGGCCAAGAA TATTGAGCGG TTAGGCCACT GAGGTTGCAC CTGTCGTACG AAGAGCAACA  780AGAGGGTAAT GGTAATAATC TATTTAACTG TTTATTAGAA AACTTGGTAT CTGTTTAATT  840AAATAACAGG AGCCTGGAAG TGGGCCAAGG CTCCTTTCTA GGGAAACCTT TTTCTATTTA  900TATAGGCGTT GTTGCCTAAG GCTAAAGTAG GATTTTATTA AAAATATAGG AATTGCTCTT  960TTATTCGACA CAATTATTCA ATGGAATACC ATAAAATGGA GAGTGTATGT AAGCGTTATA  1020TTTTATTGGG GGGCTGATAG AAGAAAAGGG ATGCGACAGG GTCTATTAGC TAGTTTGGTA  1080TTCGATTTCA GATCAATGCA ACGTACGAGT TTTTTATTGA CTGCTTTGTG CAAGCGATTG  1140CATTGAAACA AAGGAGGACA TT                                           1162(2)SEQ ID NO：15信息
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：431碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)股数：单股
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：核酸
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO：15：TAATAGAAAA AAGTAAAATC CCCTCAAGAT GTTTGAGGGG GATTTAGTTA CTTATTATCC    60AATTAATTTG CGGCTTCGGT GTTTTCAATG GGCTCCGTAT CCGTTCGGTT GTGTGATCGG   120ACAAATGGGA GTGAATAGGT CACAAGAGCA GCAGCCATTT CAAGCAGACC AGCGAAAGTA   180AACATTCGTT CTGGTGCAAA TCGGGTCATC AACCAACCGG TAATTGCTTG GGAAATAGGG   240ATGGACCCTG ACATCACGAT AATCATAATA CTAATAACAC GACCGAATAA CTTAGGTGGA   300ATAAGCGTAT GGTTAACGCT TGGAGCAATA ATATTAACCG CCGTTTCATG AGCGCCAACA   360AGCACTAGAA GGGCTAAAAT AACCCATAAG TTGTGTGTAA ATCCTATAAA AAATAACATA   420AGGCCCTGCA G                                                        431

Claims (16)

1．支链淀粉酶，其特征在于它是由脱支芽孢杆菌菌株或该菌株的衍生物或突变体产生的，它的N末端序列(SEQ ID No：1)以氨基到羧基方向并从左到右如下所示：
Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile I1e Val His
  1               5                  10
Tyr Phe Cys Pro Ala Gly Asp Tyr Gln Pro
                 15                  20
其中所述支链淀粉酶、衍生物或突变体能够催化α-1，6-糖苷键的水解。
2．分离和纯化的支链淀粉酶，其特征在于它含有如图4所示的1-928个氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID No：11)或来源于该序列的修饰序列，其中所述支链淀粉酶能够催化α-1，6-糖苷键的水解。
3．根据权利要求2的支链淀粉酶，其特征在于它以含有29个氨基酸的附加序列(SEQ ID No：12)的前体形式被合成。
4．支链淀粉酶，其特征在于它是由芽孢杆菌属的微生物以异源方式产生的，所述的微生物在野生状态含有编码碱性蛋白酶的基因，该编码碱性蛋白的基因已从芽孢杆菌属的微生物中缺失。
5．制备按照权利要求1-3中任一项之支链淀粉酶的方法，其特征在于它包括分离编码该支链淀粉酶的DNA片段，将该DNA片段插入到合适的载体中，将该载体引入到合适的宿主中或者将DNA片段引入到合适宿主的染色体中，培养该宿主，表达支链淀粉酶并收获该支链淀粉酶。
6．按照权利要求1-4中任一项的支链淀粉酶在淀粉糖化上的应用。
7．包含编码脱支芽孢杆菌支链淀粉酶之核苷酸序列(SEQ ID No：10)或由之修饰的序列的DNA分子，其中所述支链淀粉酶能够催化α-1，6-糖苷键的水解。
8．按照权利要求7的DNA分子，其特征在于它包含脱支芽孢杆菌T89．117D之支链淀粉酶的完整基因(SEQ ID No：8)。
9．含有按照权利要求7的DNA分子的表达载体或染色体整合载体。
10．表达载体pUBDEBRA1，其特征在于它具有图1所示的结构。
11．染色体整合载体pUBCDEBRA11DNSI，其特征在于它具有图3所示的结构。
12．包含按照权利要求7之DNA分子的地衣芽孢杆菌的转化菌株。
13．包含按照权利要求9之表达载体或染色体整合载体的地衣芽孢杆菌的转化菌株。
14．包含表达载体pUBDEBRA1或染色体整合载体pUBCDEBRA11-DNSI的地衣芽孢杆菌的转化菌株，其中表达载体pUBDEBRA1具有图1所示的结构，染色体整合载体pUBCDEBRA11DNSI具有图3所示的结构。
15．由按照权利要求12、13或14的地衣芽孢杆菌转化菌株产生的支链淀粉酶。
16．支链淀粉酶，其特征在于它是由保藏号为CCTCC M93078的脱支芽孢杆菌T89．117D菌株或该菌株的衍生物或突变体产生的，其中所述支链淀粉酶、衍生物或突变体能够催化α-1，6-糖苷键的水解。
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