Klinická biochemie

9.4

Jednotlivé bílkoviny krevní plazmy

Stanovují se nejčastěji imunochemickými metodami (imunoturbidimetrie, imunonefelometrie). Měří se zákal vzniklý reakcí stanovované bílkoviny (antigenu) se specifickou protilátkou v přítomnosti polyetylenglykolu (PEG). Ten podporuje shlukování imunokomplexů a tvorbu měřitelného zákalu. Má-li stanovovaná bílkovina příliš velký rozsah očekávaných koncentrací, je třeba počítat s tím, že při vysoké koncentraci bílkoviny (antigenu) může dojít k rozpuštění zákalu a vydání falešně nízkého výsledku (tzv. hook efekt).

Tento způsob stanovení je vhodný pro bílkoviny, vyskytující se v koncentraci řádově 0,01 až jednotky g/l. Je-li koncentrace bílkovin nižší, musí se užít citlivější metoda – např. turbidimetrie s protilátkami vázanými na latexové částice nebo imunochemické metody užívající značku, nejčastěji enzymová či chemiluminiscenční imunoanalýza.

U albuminu je běžné spektrofotometrické stanovení s bromkrezolovou zelení v kyselém pufru.

Nejčastěji stanovované bílkoviny krevní plazmy se dají rozdělit na dvě velké skupiny:

bílkoviny, jejichž koncentrace při zánětu, ale i v jiných zátěžových situacích, stoupá – tzv. (pozitivní) reaktanty akutní fáze;

bílkoviny, jejichž koncentrace u akutní zátěže naopak klesá; ještě výrazněji klesají při postižení proteosyntézy v játrech – tzv. negativní reaktanty akutní fáze (a ukazatele nutrice).

Změny koncentrace některých skupin bílkovin v séru u akutního zánětu; a = bílkoviny (reaktanty) akutní fáze zánětu; b = negativní bílkoviny (reaktanty) akutní fáze zánětu; c = imunoglobuliny

9.4.1

Pozitivní reaktanty akutní fáze

Reakce akutní fáze je nespecifická obranná reakce na poškození organismu. Zánět, ať už vyvolaný škodlivinou fyzikální, chemickou či infekčním agens, má své typické příznaky lokální, známé patologům po dlouhá léta. Je-li však zánět dostatečně intenzivní, projeví se i celkovou reakcí: horečkou, buněčnou odpovědí (leukocytóza); hormonální odpovědí (produkce stresových hormonů – katecholaminů a kortizolu) a změnou koncentrace tzv. bílkovin (reaktantů) akutní fáze zánětu.

Tvorba bílkovin akutní fáze zánětu probíhá v játrech a je vyvolána působením řady cytokinů, především interleukinů 1 a 6 (IL-1, IL-6) a tumor nekrotizujícího faktoru α (TNF-α). K bílkovinám akutní fáze patří α₁-inhibitor proteáz, orozomukoid, dále haptoglobin a hemopexin zabraňující poškození tkání volnými radikály, koagulační faktory (např. fibrinogen) a především C-reaktivní protein, který z uvedených bílkovin reaguje nejrychleji a jehož koncentrace stoupá nejvíce (až o dva řády).

9.4.1.1

Alfa₁-inhibitor proteáz (API)

Tento glykoprotein, zvaný též α₁-antitrypsin (AAT), se uplatňuje se jako účinný inhibitor proteolytických enzymů, uvolňovaných z makrofágů při zánětlivé reakci.

Zvýšená koncentrace doprovází akutní záněty a všechny závažné akutní stavy.

Výrazně snížená koncentrace se najde pacientů s hereditárním defektem tvorby API. Nedostatečná neutralizace účinku proteáz se projeví zejména v plicích, a to hlavně u kuřáků. Proteázy z aktivovaných leukocytů zde porušením vaziva mezi plicními sklípky působí časný rozvoj emfyzému (juvenilní emfyzém).

9.4.1.2

Alfa₁-kyselý glykoprotein (orozomukoid)

Je to glykoprotein, jehož fyziologická funkce není dosud zcela známa. Jeho koncentrace v séru stoupá u akutních stavů, klesá při poruše proteosyntézy v játrech.

9.4.1.3

Haptoglobin

Haptoglobin váže velmi pevně molekulu hemoglobinu; vzniklý komplex je rychle z krevního oběhu odstraněn především slezinou. Hlavní funkcí haptoglobinu je zábrana vzniku nebezpečných volných radikálů, na kterém se podílí hemoglobin uvolněný při hemolýze v krevním oběhu.

Vzestup koncentrace haptoglobinu pozorujeme u akutních stavů.

Pokles koncentrace doprovází poruchy proteosyntézy v játrech. Velmi nízká až neměřitelná koncentrace haptoglobinu je citlivým a poměrně specifickým ukazatelem intravaskulární hemolýzy.

Poznámka

Uvolní-li se z molekuly hemoglobinu samotný hem, brání jeho toxickému působení vazba na další plazmatickou bílkovinu, hemopexin.

9.4.1.4

Ceruloplazmin

Obsahuje ve své molekule šest atomů mědi. Kromě transportu mědi se uplatňuje jeho schopnost katalyzovat oxidaci Fe²⁺ na Fe³⁺; jen trojmocné železo se váže na transportní bílkovinu transferin a navíc se nemůže účastnit tzv. Fentonovy reakce, při které vzniká nebezpečný hydroxylový radikál:

H₂O₂ + Fe²⁺ → OH^– + ^·OH + Fe³⁺

Stoupá u akutních stavů; nízkou hladinu ceruloplazminu v krevním séru pozorujeme u Wilsonovy choroby (viz kap. 16).

9.4.1.5

Feritin

Je to zásobní bílkovina obsahující železo. Nachází se v játrech, slezině, kostní dřeni a střevní sliznici. Malý podíl se uvolňuje do krevního oběhu, kde se dá citlivými imunochemickými metodami prokázat. Koncentrace feritinu v séru odráží tkáňové zásoby železa (kap. 16), stoupá však i u akutních stavů.

9.4.1.6

C-reaktivní protein (CRP)

Název tohoto proteinu je odvozen od jeho schopnosti precipitovat C-polysacharid pneumokoků. U zdravého člověka je koncentrace CRP v plazmě velmi nízká, kolem 1 mg/l. Jeho syntéza v játrech je vyvolána cytokiny, zejména interleukinem 6 (IL-6), uvolněným z aktivovaných leukocytů při zánětu. Část molekuly CRP se podobá strukturou těžkému řetězci IgG, uplatňuje se tedy nejspíše v imunitní ochraně organismu.

Ve srovnání s jinými bílkovinami, jejichž koncentrace v séru při akutním zánětu rovněž roste, reaguje CRP nejrychleji a největším nárůstem. Nejvýraznější změny koncentrace CRP vyvolá bakteriální zánět (až stovky mg/l), u zánětů virových je nárůst malý (desítky mg/l). Jeho stanovení má význam k odlišení bakteriálního a virového zánětu, pro včasný záchyt hnisavých komplikací po operaci a pro posouzení aktivity revmatických onemocnění. Existuje přístroj, umožňující stanovení koncentrace CRP v kapilární krvi v režimu POCT; v případě vysoké hodnoty je možné včas zahájit antibiotickou léčbu např. u dětí s horečnatým stavem.

Poznámka

U podezření na sepsi se stanovuje prokalcitonin, který je v tomto případě lepším ukazatelem než CRP. I hladina prokalcitoninu však může být nespecificky zvýšena, např. u autoimunitních onemocnění, rozpadu svalů, po těžkých operacích, u popálenin aj.

9.4.1.7

Fibrinogen

Pro stanovení fibrinogenu je třeba odebrat krev do citrátu. Během hemokoagulace je působením proteolytického enzymu trombinu měněn na fibrin; následně dojde k polymerizaci monomerů fibrinu za vzniku stabilního trombu.

Vzestup koncentrace fibrinogenu je součástí akutní odpovědi organismu.

Pokles koncentrace může být způsoben nedostatečnou syntézou u selhání jater nebo zvýšenou spotřebou, např. při diseminované intravaskulární koagulaci (DIC).

9.4.2

Negativní reaktanty akutní fáze a ukazatele nutrice

Patří mezi ně albumin, prealbumin a transferin a některé další bílkoviny krevního séra (např. koagulační faktor protrombin, ale i enzym cholinesteráza). Příčinou poklesu jejich plazmatické koncentrace v akutních stavech je nejspíše omezená proteosyntetická kapacita jater, která tvoří přednostně (pozitivní) bílkoviny akutní fáze zánětu nezbytné pro jeho překonání.

Protože všechny tyto bílkoviny vznikají v hepatocytech, pokles jejich koncentrace v séru najdeme i u poruchy funkce jater, např. u jaterní cirhózy, a u podvýživy.

9.4.2.1

Albumin

Albumin tvoří více než polovinu všech plazmatických bílkovin. Pro vysokou koncentraci v plazmě (35 – 53 g/l) a relativně malou molekulu (M_r 66,5 kDa) má význam pro udržení vody v krevním řečišti. Má relativně velký negativní náboj, a protože má ze všech plazmatických bílkovin nejvyšší koncentraci, podílí se významně na množství aniontů v krevní plazmě.

Důležitá je i transportní funkce albuminu: přenáší nekonjugovaný bilirubin, neesterifikované (volné) mastné kyseliny, hormony štítné žlázy, vápník, hořčík, zinek a jiné minerály. Váže se na něj značný podíl mnohých léků. Albumin má význam pro udržení acidobazické rovnováhy a uplatňuje se v ochraně proti volným radikálům.

Hypoalbuminémie je častý nález u různých chorob; k jejím příčinám patří:

snížená syntéza u pokročilého onemocnění jater a proteinové malnutrice; u akutních stavů se projeví poměrně pozdě pro dlouhý biologický poločas albuminu (20 dní);

zvýšený katabolismus u nemocných s akutními záněty, nádory a v akutních stavech;

zvýšené ztráty, nejčastěji ledvinami do moči (nefrotický syndrom);

převodnění pacienta s naředěním vnitřního prostředí;

fyziologicky v těhotenství, kdy roste objem cirkulující plazmy.

9.4.2.2

Prealbumin (transthyretin)

Slouží jako transportní protein pro hormony štítné žlázy. Vytváří komplex s bílkovinou transportující vitamin A (retinol-binding protein, RBP). Brání tak ztrátám vitaminu A do moči – samotný RBP by jakožto mikroprotein pronikl zdravým glomerulem do moči. Další název prealbuminu je transthyretin – popisuje vlastně funkci této bílkoviny (transports thyroxine and retinol).

Pokles koncentrace prealbuminu je výrazem poruchy proteosyntézy v játrech; protože má biologický poločas jen asi 2,5 dne, reaguje změnou koncentrace velmi rychle.

9.4.2.3

Transferin

Jeho funkcí je transport železa v krvi a zároveň zajišťuje, že se železo nevyskytuje v plazmě ve volné formě. Za fyziologických okolností je nasycen železem jen asi z 30 %. Saturaci transferinu železem lze spočítat podle vzorce:

s a t u r a c e t r a n s f e r i n u [%] = \frac{S - ž e l e z o [µ m o l / l]}{S - t r a n s f e r i n [g / l]} \times 4

Vzestup koncentrace transferinu doprovází nedostatek železa v organismu.

Pokles koncentrace transferinu v séru najdeme u přebytku železa a při poruše proteosyntézy v játrech.

Poznámka

U alkoholiků nacházíme v séru frakci transferinu se sníženým podílem cukerné složky (tzv. bezsacharidový transferin, carbohydrate-deficient transferrin, CDT). Etanol snižuje syntézu vedlejších sacharidových řetězců transferinu v Golgiho aparátu jaterních buněk. CDT proto používáme jako marker chronického abúzu alkoholu.

9.4.3

Imunoglobuliny

Všechny imunoglobuliny mají obdobnou stavbu molekuly. Ta je tvořena dvěma páry těžkých (H, heavy) a dvěma páry lehkých (L, light) řetězců, spojených disulfidickými můstky.

Schéma struktury molekuly imunoglobulinu

Rozeznáváme těžké řetězce pěti typů (γ, α, µ, δ a ε), podle nichž se odlišuje pět tříd imunoglobulinů (IgG, A, M, D a E). Lehké řetězce jsou dvou druhů (kappa a lambda). Molekula imunoglobulinu má oba těžké i lehké řetězce vždy stejného typu.

Každý imunoglobulin je schopen vázat dva identické antigeny částí molekuly, obsahující těžké i lehké řetězce (Fab, antigen-binding). Struktura koncové, variabilní části určuje specifičnost vazby konkrétního antigenu.

IgG protilátky tvoří největší podíl plazmatických imunoglobulinů. Vznikají jako odpověď na rozpustné antigeny (toxiny a produkty lýzy baktérií).

IgA protilátky se vyskytují v plazmě jako monomer, na povrchu sliznic (GIT, spojivky, dýchací cesty) ve formě dimerů. Brání povrch sliznic před bakteriální infekcí.

IgM protilátky se vyskytují v plazmě jako pentamer. Vznikají zejména jako reakce na bakteriální a virovou infekci, a to časně. Jejich syntéza je později vystřídána syntézou protilátek třídy IgG.

IgD protilátky se vyskytují v krvi ve velice nízké koncentraci; jejich význam je dosud neznámý.

IgE protilátky se tvoří jakožto reaginy u alergiků. Jejich komplex s alergenem vyvolá uvolnění histaminu a dalších mediátorů alergické reakce z žírných buněk. Analyticky se dají odlišit IgE specificky reagující s konkrétními alergeny.

Změny koncentrace imunoglobulinů zahrnují sníženou a zvýšenou koncentraci Ig v plazmě.

9.4.3.1

Hypoimunoglobulinémie

fyziologicky u novorozenců a kojenců;

dědičné poruchy syntézy;

získané poruchy syntézy, zejména u některých nádorů;

ztráta imunoglobulinů, např. močí při těžkém nefrotickém syndromu.

9.4.3.2

Hyperimunoglobulinémie

polyklonální hyperimunoglobulinémie, kdy vznikají protilátky různých typů (chronické záněty, jaterní cirhóza, autoimunitní choroby);

monoklonální hyperimunoglobulinémie s tvorbou jediného typu Ig a úzkým pruhem při elektroforéze u mnohočetného myelomu a příbuzných chorob.

Souhrn

Po krátkém přehledu popisujícím stavbu peptidů a bílkovin se kapitola věnuje plazmatickým (sérovým) bílkovinám. Stručně je probrán význam plazmatických bílkovin a zhodnocena metoda stanovení celkových bílkovin. Následuje kapitola o elektroforéze bílkovin krevního séra a jsou popsány základní elektroforetické typy; podrobněji je probrána problematika monoklonální gamapatie, kde má stále elektroforéza (spolu s imunofixací) velký význam. Poslední část kapitoly je věnována významu jednotlivých plazmatických bílkovin, které jsou rozděleny na pozitivní reaktanty akutní fáze a negativní reaktanty akutní fáze (ukazatele nutrice). Stručně jsou popsány metody stanovení plazmatických bílkovin a u jednotlivých bílkovin je probrána jejich fyziologická úloha a diagnostický význam stanovení.

Student charakterizuje stavbu bílkovin a uvede význam plazmatických bílkovin. Popíše stanovení celkových bílkovin biuretovým činidlem a vysvětlí princip elektroforézy. Vysvětlí pojem elektroforetické typy a podrobněji rozebere pojem monoklonální gamapatie. Vysvětlí princip imunonefelometrického a imunoturbidimetrického stanovení jednotlivých bílkovin. Zdůvodní rozdíl mezi pozitivními a negativními reaktanty akutní fáze a na příkladech demonstruje jejich diagnostické užití.